骨痹顆粒防治兔骨關節炎的作用及機制

周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

(南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023)

?

骨痹顆粒防治兔骨關節炎的作用及機制

周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

(南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023)

目的 觀察骨痹顆粒對兔骨關節炎(OA)的治療作用機制。方法 兔隨機分為正常對照組、模型組、塞來昔布組及骨痹顆粒2.78，5.56，11.12 g生藥/kg三個劑量組；采用兔關節腔注射木瓜蛋白酶法建立OA模型，連續給藥8 w，檢測家兔血清中白細胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1含量及關節液中誘導型一氧化碳合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平，觀察兔關節病理組織學變化。結果 骨痹顆粒5.56，11.12 g生藥/kg可抑制炎癥因子IL-1β及PGE2的生成，降低MMP-1及MMP-3水平，提高TIMP-1水平，抑制關節液中iNOS表達及NO釋放，減輕關節軟骨病變，降低關節Mankin評分。結論 骨痹顆粒對兔OA具有良好的治療作用，其機制與抑制炎癥介質和炎性因子生成、調節基質合成與分解代謝平衡有關。

骨痹顆粒；骨關節炎；炎性因子；金屬蛋白酶

骨關節炎(OA)是機械力學和生物學事件的共同作用下所導致的關節的軟骨細胞、細胞外基質(ECM)，及軟骨下骨的降解和合成作用之間失衡的結果〔1〕，流行病學調查結果顯示50歲以上人群OA致殘率在長期致殘疾病排名中僅次于心血管疾病〔2〕，因此，OA的防治也成為醫學界研究的熱點。中醫藥在防治骨關節疾病方面具有獨特療效，周仲瑛教授結合臨床應用數十年的經驗，采用桑寄生、懷牛膝、川斷等8味中藥，通過現代方法精制成骨痹顆粒，臨床研究證明該藥可有效抑制炎癥，延緩關節退變，減輕患者痛苦。為了進一步明確其對OA的療效，本課題采用關節腔注射木瓜蛋白酶建立家兔骨關節炎的模型，觀察骨痹顆粒對其作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 骨痹顆粒由江蘇省植物藥研究與新藥開發中心提供，含6 g生藥/g；塞來昔布，輝瑞制藥有限公司；兔IL-1β、前列腺素(PG)E2、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1酶聯免疫分析試劑盒，均購自上海源葉生物科技有限公司；一氧化氮(NO)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 Synergy HT型酶標儀，美國Bio-Tek公司；TS25-WS型離心機，上海盧湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨關節炎模型的建立〔3,4〕將兔固定于兔臺，膝關節備皮，消毒并屈曲右膝關節，于髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm處進針，將0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶注入關節腔內，每隔3 d注射1次，共注射3次。正常對照組注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 分組及給藥 家兔48只，體重2～2.5 kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2012-0008。雌雄各半，隨機分為6組：分別為①正常對照組；②模型組；③塞來昔布組：7.67 mg/kg；④骨痹顆粒低劑量組：2.78 g生藥/kg；⑤中劑量組：5.56 g生藥/kg；⑥高劑量組：11.12 g生藥/kg。各組于造模完成后次日開始分別灌胃給予相應的藥物，給藥體積為3 ml/kg，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，共8 w。

1.3.3 指標檢測 給藥結束后各組家兔心臟取血，離心取血清，ELISA法檢測血清中IL-1β、PGE2、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的含量；處死家兔，用注射器抽取1 ml生理鹽水，注入關節腔，反復屈膝后抽取關節液，離心后測定關節液中NO及iNOS含量；取造模側關節股骨內髁固定，常規處理，切片，行HE染色作病理組織學檢查，阿爾新蘭染色觀察基質染色情況，并按照Mankin評分標準進行評分〔5〕。

1.4 統計學方法 采用Graph Pad Prism 5軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 骨痹顆粒對OA兔血清中IL-1β、PGE2含量的影響 模型組較正常對照組兔血清中IL-1β、PGE2含量均顯著升高(P<0.01)，骨痹顆粒中、高劑量組與模型組比較，血清中IL-1β、PGE2含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且存在一定的劑量依賴性。見表1。

表1 骨痹顆粒對OA兔血清IL-1β、PGE2含量的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 骨痹顆粒對OA兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響 模型組兔血清中MMP-1、MMP-3含量較正常對照組明顯升高，TIMP-1含量較正常對照組明顯降低(P<0.01)，骨痹顆粒中、高劑量組血清MMP-1、MMP-3含量較模型組明顯降低，TIMP-1含量較模型組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 骨痹顆粒對兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響

2.3 骨痹顆粒對OA兔關節液NO、iNOS含量的影響 模型組兔關節液NO、iNOS含量較正常對照組明顯升高(P<0.01)；骨痹顆粒低劑量組兔關節液NO含量明顯低于模型組(P<0.05)，但iNOS含量變化較模型組無明顯降低；骨痹顆粒中、高劑量組兔關節液NO 、iNOS含量較模型組均有顯著下降(P<0.01)。見表3。

表3 骨痹顆粒對兔關節液NO 、iNOS含量的影響

2.4 骨痹顆粒對OA兔關節軟骨病理組織學改變的影響 家兔關節病理組織學檢查結果顯示：正常對照組兔關節軟骨結構完整，表面光滑，無裂隙，分層規則，細胞排列整齊，潮線清晰完整。模型組兔關節軟骨表面粗糙不平，出現裂隙，分層不清晰，結構紊亂，軟骨細胞中度或重度增生，伴有大量簇集現象，潮線模糊，或被血管穿過。骨痹顆粒低劑量組兔關節軟骨細胞排列紊亂但層次可分，軟骨細胞輕度至中度增生，部分有簇集現象，局部區域缺失，潮線紊亂；中劑量組兔關節軟骨表面較平滑，有少許裂隙排列紊亂但層次可分，軟骨細胞排列整齊，輕度增生，潮線完整，可見多層次潮線；高劑量組兔關節軟骨表面較平滑，分層基本清楚，細胞輕度增生，潮線清晰可見。見圖1。兔軟骨Mankin評分結果顯示：模型組兔關節Mankin′s評分較正常對照組明顯升高〔(8.00±1.31)vs(0.00±0.00)，P<0.01〕；骨痹顆粒中、高劑量組兔關節Mankin評分〔(6.25±1.83)，(6.13±1.55)〕較模型組明顯降低(P<0.05)。塞來昔布組、骨痹顆粒低劑量組〔(6.57±2.07)、(7.50±1.52)〕與模型組無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組兔關節病理組織學改變(HE，×40)

3 討 論

OA主要病理改變為軟骨退行性病變、基質降解、骨贅形成等。周仲瑛教授根據數十年臨床經驗確立補腎蠲痹通絡法治療OA〔6〕，據此選藥組成骨痹方。方中桑寄生益肝腎、祛風濕、強筋骨，雞血藤養肝血、柔筋脈、和血絡，兩者共為君藥。懷牛膝、川斷、骨碎補共為臣藥，補肝腎、強筋骨、活血止痛，增強桑寄生補肝腎、強筋骨的功效。千年健和土鱉蟲共為佐藥，祛風濕、破瘀血、壯筋骨、止痛消腫；油松節祛風濕、通絡止痛，善走骨節、直達病所為使藥。諸藥合用共奏平補肝腎、蠲痹通絡之功效，可延緩關節軟骨的退行性變，充分體現治病求本之旨。

課題首先采用木瓜蛋白酶關節腔內注射誘發兔OA，動物可觀察到關節病變，炎癥性細胞因子過度分泌和金屬蛋白酶水平異常等癥狀，與人骨關節炎病理變化較為類似。在此基礎上觀察骨痹顆粒的作用，結果顯示其可以減輕兔骨關節病理組織學改變，降低Mankin評分，表明其對OA的局部病變有較好的作用。細胞因子的合成與分解途徑的失衡是OA關節軟骨毀損中最為基本的因素，其中IL-1β的大量釋放，可刺激軟骨細胞和滑膜產生MMPs，促進軟骨基質的降解，還可誘導環氧化酶(COX)-2和iNOS的表達，促進PGE2、NO的合成〔7,8〕。PGE2可增加毛細血管通透性，抑制蛋白多糖合成，激活MMPs，并促進膠原酶產生，導致軟骨基質降解破壞〔9,10〕。此外，PGE2對IL-1β的表達具有正反饋的作用，從而進一步誘導軟骨細胞凋亡〔11〕。高水平的NO在OA可促進PGE2釋放，加重炎癥反應，誘導軟骨細胞凋亡，還能激活多種潛在的膠原酶、明膠酶和組織纖溶酶原激活物，抑制軟骨基質合成，促進Ⅱ型膠原降解，最終導致軟骨進行性退化〔12,13〕。本研究結果顯示，骨痹顆粒能夠明顯抑制OA兔血清中IL-1β、PGE2等炎癥因子的產生，并進一步抑制兔關節腔內iNOS的過度表達，減少NO的分泌，提示抑制炎癥性細胞因子和炎癥介質的釋放是其治療OA的機制之一。

細胞外基質主要由膠原與蛋白多糖構成，是軟骨的主要組成部分，在維持軟骨功能方面有著重要的作用，其合成與降解代謝保持動態平衡〔14〕。MMPs是基質降解的主要介質，其中MMP-1和MMP-3是參與軟骨基質降解的重要介質，并受TIMP-1的調節〔15〕，目前已作為判斷療效的指標之一。本課題研究結果表明骨痹顆?？筛纳苹|代謝平衡，延緩關節軟骨退變。炎癥因子IL-1β等的升高，也可刺激軟骨及滑膜MMPs表達上調，TIMPs表達下調，導致MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞，因此推測骨痹顆粒對MMP的作用除直接作用外，還可能與其抑制炎癥因子的作用相關。

綜上，骨痹顆粒可保護OA動物的關節軟骨，延緩軟骨退變的發生與發展，抑制炎癥因子的生成，調節基質代謝平衡，對OA具有良好的防治作用。

1 竇曉麗,段曉琴,夏 玲,等.骨關節炎:關節軟骨退變的相關研究與進展〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2011；20(15):3763-6.

2 Berenbaum F.New horizons and perspectives in the treatment of osteoarthritis 〔J〕.Arthritis Res Ther,2008；10(suppl 2):S1.

3 孫魯寧,黃桂成,趙燕華,等.木瓜蛋白酶誘導兔膝關節骨關節炎模型滑膜中白細胞介素1、白細胞介素6、白三烯濃度變化與藥物注射時間的關系〔J〕.中國組織工程研究,2012；33(16):6184-8.

4 鄧 宇,伍筱梅,任醫民,等.關節腔內注射不同蛋白酶建立兔膝骨關節炎模型的對比研究〔J〕.中華關節外科雜志(電子版),2009；3(3):332-9.

5 van der Sluijs JA,Geesink RG,van der Linden AJ,etal.The reliability of the Mankin score for osteoarthritis〔J〕.J Orthop Res,1992；10(1):58-61.

6 劉志宇,周學平.中醫藥治療骨關節炎療效機理研究進展〔J〕.遼寧中醫藥大學學報,2008；10(11):62-3.

7 Li X,Ellman M,Muddasani P,etal.Prostalandin E2 and its cognate EP receptors control human adult articular cartilage homeostasis and are linked to the pathophysiology of ostearthritis〔J〕.Arthritis Rheum,2009；60(2):513- 23.

8 Baugé C,Attia J,Leclercq S,etal.Interleukin-1beta up-regulation of Smad7 via NF-kappaB activation in human chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2008；58(1):221- 6.

9 譚旭儀,劉立云,高書圖,等.筋骨痛消丸對膝骨性關節炎患者 WOMAC評分及PGE2、 MMP-3的影響〔J〕.中國中醫骨傷科雜志,2014；222(2):18-20.

10 Attur M,Al-Mussawir HE,Patel J,etal.Prostalandin E2 exerts catabolic effects in ostearthritis cartilage:evidence for signaling via EP4 receptors〔J〕 .J Immunol，2008;181(7):5082-8.

11 Martel-Pelletier J,Pelletier JP,Fahmi H.Cyclooxygenase-2 and prostaglandins in articular tissues〔J〕.Semin Arthritis Rheum,2003；33(3):155-67.

12 Vuolteenaho K,Moilanen T,Hamalainen M,etal.Regulation of nitric oxide production in osteoarthritic and rheumatoid cartilage.Role of endogenous IL-1 inhibitors〔J〕.Scandinavian J Rheumatol,2003；32(1):19-24.

13 肖彩芝,李榮亨,曾 麗,等.復元膠囊對大鼠膝骨關節炎軟骨iNOS及血清PGE2、NO的影響〔J〕.中國老年學雜志,2011；31(9):1580-2.

14 尤笑迎.降鈣素對兔膝骨性關節炎Ⅱ型膠原和基質蛋白酶-1的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(1):130-2.

15 Goldring MB.Chondrogenesis,chondrocyte differentiation and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis〔J〕.Ther Adv Musculoskelet Dis，2012；4(4):269-85.

〔2015-05-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江蘇省科技廳社會發展項目(No.BE2011847)

周玲玲(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中藥藥理學、免疫藥理學等方面研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)20-4975-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.015