腦出血灶周MMP-9的表達與腦水腫的實驗研究

董　靜，劉　群

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腦出血灶周MMP-9的表達與腦水腫的實驗研究

董靜1，劉群2

目的明確腦出血后灶周腦組織不同時間點MMP-9蛋白的表達規律，在腦水腫的發生、發展過程中可能作用，相關性及臨床意義。方法本研究以不同時間點高血壓腦出血患者開顱手術中取的腦出血灶周組織為實驗組標本，按腦出血發病時間分為6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d組。以手術入路時少量破壞的腦組織做為對照組標本，通過干濕比重法測腦組織含水量，同時應用HE染色，RT-PCR方法觀察各時間點各組腦出血灶周腦組織MMP-9的表達變化。結果(1)腦出血灶周腦組織含水量的變化：腦出血后灶周腦水腫程度隨出血時間的延長逐漸增加，在出血6 h內含水量即開始增加，24 h后較6 h明顯增高，3 d左右達到峰值，之后減輕(P<0.05);(2)在人腦出血血腫灶周中MMP-9圴有表達，出血組與對照組相比均有顯著性意義(P<0.05)，且出血各組之間比較均有差異(P<0.05)。出血6 h 后免疫陽性細胞數開始增加，3 d 組陽性細胞數最多，之后逐漸下降。MMP-9與腦水腫成正相關。結論(1)腦出血灶周MMP-9的表達與腦水腫密切相關;(2)在高血壓腦出血后腦水腫中MMP-9的異常表達起重要作用，促進腦水腫的發生，為腦出血的治療提供新的靶點。

腦出血；MMP-9；免疫組織化學；RT-PCR

基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloporteinases-9，MMP-9)是基質金屬蛋白酶(matrixmetalloporteinases，MMPs)中的重要成員，MMP-9主要作用于細胞外基質中的纖粘蛋白、層粘蛋白及Ⅳ型膠原蛋白，通過降解細胞基底膜、破壞血腦屏障，造成血管源性水腫，從而加重腦水腫。大量動物研究已證明MMP-9在腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)急性期與腦水腫呈正相關，但尚未在人ICH灶周腦組織中得到證實。本研究采用人ICH血腫灶周組織，應用免疫組化法觀察ICH血腫周邊腦組織中MMP-9蛋白的表達情況，并驗證MMP-9蛋白表達與腦水腫程度之間的關系。

1　材料和方法

1.1一般資料2013年1月-2013年12月在吉林醫藥學院附屬醫院神經外科的患者，24例原發性高血壓ICH，經顳葉入路行血腫清除術患者，全部為基底節區出血，所有患者均符合全國第四屆腦血管病學術會議制定的ICH診斷標準。

1.2標本的抽取全部患者在經顳葉皮質“造瘺”清除血腫時，將入路通道范圍內緊鄰血腫的腦組織保存下來，做為實驗組標本，大小約0.1～0.15 mm3，按發病時間分為<6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d組。將部分患者皮質“造瘺”起始處腦組織，做為對照組標本，共6例。將所取的腦組織分兩部分，一部分組織于10%福爾馬林固定液中浸泡固定后石蠟包埋；一部分用液氮運送至-70 ℃冰箱凍存。連續切片進行HE染色和MMP-9免疫組化染色。另取ICH灶周邊腦組織約100 mg進行腦組織含水量測定。

1.3MMP-9免疫組化SP法檢測鼠抗人MMP-9單克隆抗體購于美國SANTA公司，DAB顯色試劑盒、SP-9710試劑盒均購于福州邁新生物技術開發有限公司。免疫組化過程按試劑盒說明進行，以PBS代替一抗作陰性對照。免疫組化染色細胞質陽性為棕黃色，胞漿呈紅色，胞核呈藍色，紅細胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色。數碼相機拍照，在對照組和血腫周圍隨機各取5個視野，圖像采用Motic Images advanced 3.2彩色圖像分析系統，所測得的灰度值越小陽性越強，灰度值越大陽性越弱。

1.4RT-PCR方法檢測MMP-9mRNA定量Rtizol裂解細胞后抽提總RNA，取1 ml測光密度值，DNA消化。使用日本Toyobo公司試劑盒逆轉錄體系進行cDNA合成。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司設計合成，序列如下：上游：ACGTGACCTATGACATCCTGC，下游：GAGAAGAGAGGGCCCAGC。PCR體系：cDNA：2 μl，Taq酶0.25 μl，總反應體系：25 μl。PCR循環參數： 94 ℃預變性，2 min， 94 ℃變性，30 s，30次循環，55 ℃退火，30 s，30次循環，72 ℃延伸，1 min，30次循環。反應后將制備好的cDNA放-20 ℃冷凍保存。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析。通過凝膠成像系統進行拍照，記錄結果。產物定量分析：利用ABI PRISM 7700 Sequence Detector，檢測每個循環的熒光強度，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

1.5腦組織含水量測定采用干濕比重法測定腦組織含水量，取腦組織約100 mg，電子天平稱濕重后置于105 ℃烤箱烘烤48 h至恒重，稱取干重。換算公式：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，精確度為0.2 mg。

2　結　果

2.1免疫組化檢測MMP-9MMP-9主要在血管內皮細胞可見表達，著色部位為細胞漿，DAB染色成棕褐色(見圖1、圖2)。對照組及實驗組的灰度值測定(見表1)，在ICH后6 h，MMP-9陽性細胞開始增加，灰度值下降，24 h～3 d陽性細胞數最多，之后逐漸下降，灰度值上升。對照組與實驗組各組相比均有統計學意義(P<0.05)，且出血組各組之間亦有差異(P<0.05)。

表1　各組MMP-9灰度值的比較

與對照組相比aP<0.05；與<6 h組比較bP<0.05；與6～24 h組比較cP<0.05；與24 h～3 d 組比較dP<0.05

2.2RT-PCR經PCR擴增后，MMP-9 mRNA表達產物在近178 bp處出現，分別于觀察對照組及實驗組MMP-9 mRNA在各時間點的表達，MMP-9的PCR產物相對定量分析結果(見表2、圖3)，結果可見對照組中有少量表達，血腫灶周6 h出現MMP-9陽性細胞，24 h進一步增加，24 h～3 d時MMP-9陽性細胞表達達高峰，3 d后仍可見MMP-9的表達，但較3 d時下降(兩組相比均有統計學意義，P<0.05)。

2.3ICH后腦組織含水量的變化在出血6 h含水量即開始增高，24 h后較6 h明顯增高，3 d左右達到峰值，之后減輕(P<0.05)(見表3)。

2.4ICH組MMP-9灰度值與腦組織水含量關系用直線回歸進行分析顯示(見圖4)：ICH后各時間點HMMP-9灰度值與腦組織水含量的變化呈負的直線相關關系(r=-0.85849，P<0.001)，24 h～3 d 顯著降低(P<0.05)，3 d 達到最低；MMP-9含量與腦組織含水量均表現出一致的時相依賴性變化，即隨著MMP-9表達的增加腦組織水含量也增加，且相關關系非常密切。

表2　ICH后MMP-9 mRNA表達

與對照組比較*P<0.05

表3　各組腦組織含水量的比較

與對照組相比aP<0.05；與<6 h組比較bP<0.05；與6～24 h組比較cP<0.05；與24 h～3 d組比較dP<0.05

圖1　6～24 h組MMP-9陽性表達細胞(SP×400)

圖2　24 h～3 d MMP-9陽性表達細胞(SP×400)

圖3　MMP-9的PCR產物相對定量分析

圖4　出血灶周腦組織含水量與MMP-9灰度值表達

3　討　論

近二十余年來，已達成專家共識，凝血酶本身是引起ICH早期腦水腫的重要因素。近年來， Kawakita K等[1]在沙鼠腦實質研究中發現凝血酶可促進MMP-9的表達和激活。凝血酶誘導的炎性反應和炎性介質的釋放及氧化應激反應，可使內皮細胞的MMP-9活化，導致BBB的滲透性增加[2]，與凝血酶誘導的MMPs表達、損傷血管基膜有關[3]。因此，我們考慮ICH后凝血酶和MMP-9共同參與了腦水腫的形成。本研究發現：ICH中MMP-9的表達具有以下3個特點：(1)在正常腦組織中MMP-9無表達；(2)ICH后可有大量MMP-9的表達，持續時間較短暫，3 d時達高峰；(3)MMP-9表達部位主要為神經元、膠質細胞及內皮細胞。

ICH后MMP-9在各時間點的表達出血組與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.05)，6 h MMP-9表達上升，在3 d達高峰，以后逐漸下降；MMP-9含量與腦組織含水量均表現出一致的時相依賴性變化，二者呈正相關，與國內學者在ICH患者外周血清中放射免疫法檢測結果一致。目前，大量的研究表明，ICH后MMPs家族中MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12等蛋白表達或活性增加，它們從ICH4 h后表達就明顯增加[4]。Power[5]等在ICH動物實驗中發現MMP-2、MMP-3、MMP-9的mRNA 表達增加。Gursoy-Ozdemir等學者發現，存在腦水腫的ICH大鼠表達MMP-9，同時發生血漿蛋白的漏出，而無血漿蛋白漏出的大鼠中MMP -9表達陰性，提示MMP-9與BBB破壞有關[6]。結合以上文獻，提示MMP-9的表達增加可能是ICH后早期血管源性腦水腫形成的重要原因之一[7～9]。

Lvarez-Sabin研究發現，ICH后3 d MMP-9達高峰，其含量與血腫周圍水腫體積呈正相關，而其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)的含量與血腫周圍水腫體積呈負相關，說明抑制ICH后MMP-9的表達，是防治ICH后血管源性腦水腫形成的一個新的潛在途徑。Abilleira等[10]研究59例發病24 h 內ICH患者血清MMP-9的含量發現，MMP-9含量升高與腦水腫的加重相關。對基底節區ICH而言，MMP-9的升高預示著病情的加重。在本實驗中，我們得出的結論與Abilleira等人的結論部分相似，MMP-9表達在3 d達高峰，以后逐漸下降，MMP-9含量與腦組織含水量均表現出一致的時相依賴性變化。有研究發現，ICH后血腫周圍水腫和神經功能障礙與MMP-9的表達有密切聯系，MMP-9表達越顯著，神經功能障礙越嚴重。因此，針對ICH后的腦水腫的臨床治療是關系到ICH患者預后的一項極其重要的干預措施。國內研究認為丁苯酞可能通過抑制MMP-9的表達，減少血腦屏障基底膜降解，發揮腦保護作用。

近年研究證明，MMPs被認為是血管新生的“開關”[11]。MMPs參與了ICH后的血管新生。有研究表明，在傷口愈合、新生血管形成、腫瘤侵襲轉移、炎癥反應及纖維化等過程中，MMPs的表達量明顯增加。血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)已被證實對血管新生和神經保護或刺激神經發生有特異作用[12]，且VEGF可誘導細胞MMPs基因的轉錄，導致了血管新生和血管通透性增加。MMPs在腦組織的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)恢復期重塑起到了重要作用，ECM和毛細血管內皮下基底膜的降解是血管新生的一個關鍵步驟，為內皮細胞增殖、新生血管的出芽、遷移、血管延伸創造條件，并且MMPs能調節內皮細胞的形狀、MMPs與血管新生關系密切[13]。

綜上所述，MMPs在ICH起著“雙刃劍”的作用。一方面，MMPs促進組織修復，為突觸重塑掃清道路，誘導血管新生；另外一方面，MMPs破壞血腦屏障，加重腦水腫，還直接損傷神經元細胞。TIMP-1和MMP-9的平衡，對于ECM完整性的保持，重塑細胞外基質方面具有重要作用。故在ICH中，調節MMP-9和TIMP-1的平衡，有可能成為ICH新的治療策略。

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[3]Zheng GQ,Wang XT,Wang XM,et al.Long-time course of protease activated receptor-1expression after intracerebral hemorrhage in rats[J].Neurosci Lett,2009,459:62-65.

[4]Wang Jian,Tsirka S.Neuroprotection by inhibition of matrix metalloproteinases in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J].Brain,2005,128:1622-1633.

[5]Power C,Herry S,Del Bagnio MR,et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinase[J].Neural,2003,53(6):731-742.

[6]Gursoy-Ozdemir Y,Qiu J,Matsuoka N,et al.Cortical spreading depression activates and up regulates MMP-9[J].ClinInvest,2004,113(10):1447-1455.

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Experimental study on the expression of cerebral hemorrhage perifocal MMP-9 and brain edema

DONGJing，LIUQun.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofJilinMedicalUniversity,Jilin132021,China)

ObjectiveTo clear the cerebral hemorrhage perifocal brain tissue at different time points of MMP-9 protein expression pattern the possible role of the occurrence and development of cerebral edema correlation and its clinical significance.MethodsThe cerebral hemorrhage foci were taken during the craniotomy operation for patients with cerebral hemorrhage at different time points.The patients were divided into<6 h，24 h～3 d，6～24 h and >3 d groups according to the time of onset.To operative cranial path away from the hematoma at a little damage of brain tissue do as the samples in the control group by dry wet weighing method in measuring the brain water content，and immunohistochemical staining and RT-PCR methods observe changes of brain tissue around the MMP-9 expression in each group at different time points lesions.Results(1)The water content of brain tissue changeds，cerebral hemorrhage cerebral edema with bleeding time increased，in 6 h containing water hemorrhage increased significantly，after 24 h significantly increased，peaked in about three days，then reduced (P<0.05).(2)In the human brain hemorrhage perifocal MMP-9 shall have expression expressed，as compared with the control group，hemorrhage group were significant(P<0.05) compared to and bleeding between groups comparison showed a significant difference (P<0.05).The number of immune positive cells increased after bleeding 6 h，and the cell numbers of 24 h～3 d cells was the most，then decreased gradually.MMP-9 was positively related to cerebral edema.Conclusion(1)The expression of MMP-9 in the human brain was significantly higher which was closely related to cerebral edema.(2)Abnormal expression of MMP-9 plays an important role in cerebral edema after hypertensive intracerebral hemorrhage and promotes the occurrence of cerebral edema and provides a new target for the treatment of cerebral hemorrhage.

Intracerebral hemorrhage；MMP-9；Immunetissuechemistry；RT-PCR

1003-2754(2016)02-0157-04

2015-10-23；

2015-11-29

吉林省衛生廳課題 (No.2012ZC017)

(1.吉林醫藥學院附屬醫院神經內科,吉林 吉林 132012；2.吉林大學白求恩第一醫院神經內科，吉林 長春 130021)

劉群，E-mail：liufanxiaolin@163.com

R743.34

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