重癥肌無力患者外周血Foxp3和CD152表達變化及其相關性分析

張哲峰，梁華剛，薛　雷，杜海榮，張　璐，賈　瑞，高　鯤

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重癥肌無力患者外周血Foxp3和CD152表達變化及其相關性分析

張哲峰，梁華剛，薛雷，杜海榮，張璐，賈瑞，高鯤

目的研究重癥肌無力(MG)患者經全胸腺切除治療外周血中調節性T細胞(CD4+CD25+Treg)中Foxp3及CD152(CTLA-4)的表達情況。方法采集重癥肌無力經手術切除胸腺患者50例術前和術后6個月外周血為實驗組，對照組為25例健康志愿者的外周血。應用流式細胞分析方法檢測患者手術前后和健康志愿者外周血中的調節性T細胞Foxp3及CD152(CTLA-4)的表達情況。結果患有MG患者術前外周血中調節性T細胞Foxp3及CD152(CTLA-4 )表達水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)；全胸腺切除6個月后CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及CD152(CTLA-4)表達比例與手術前比較升高(P<0.05)，與健康對照組比較水平低(P<0.05)；調節性T細胞中Foxp3表達水平與CD152 (CTLA-4 )表達水平呈現一定的正相關性(P<0.001)。結論重癥肌無力患者外周血調節性T細胞中Foxp3和CD152(CTLA-4)表達水平較低,手術治療能夠明顯提高Foxp3及CD152(CTLA-4),然而與正常人比較還不能達到正常的水平，為重癥肌無力發病機制與胸腺切除治療提供了理論依據。

Foxp3；CD152(CTLA-4)；重癥肌無力；全胸腺切除

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是乙酰膽堿受體抗體介導、T細胞依賴、補體參與的發生于神經肌肉接頭處的自身免疫性疾病[1]。一些研究顯示行胸腺切除術后的MG患者細胞免疫、體液免疫均受抑制，提示胸腺在MG的發生發展中起重要作用[2,3]。CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)是維持機體內穩態的重要細胞，具有免疫抑制功能，參與多種免疫性疾病的發生，而Foxp3是其特異性表達的轉錄因子，它的突變或表達減少或功能下降均會導致Treg數量減少或功能缺陷，從而導致MG等自身免疫疾病的發生[4]。研究人員[5]表明Foxp3和CD152水平可較好地反映Treg細胞功能狀態。本研究旨在通過檢測MG患者手術前、術后及健康對照組外周血CD4+CD25+Treg中Foxp3和CD152的水平變化來探討MG這種疾病的發病機制，以及全胸腺切除治療重癥肌無力的理論依據。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2014年1月-2015年6月秦皇島市第一醫院胸外科住院的MG手術患者共50例,年齡23～72(46.2±10.1)歲,男女性別比9 ∶16。患者均根據臨床癥狀、新斯的明試驗、乙酰膽堿受體抗體、重頻刺激試驗和肺部CT確診為MG,并排除了其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴重感染、嚴重器官不全等患者。另將25例健康體檢者作為對照組,年齡22～68(43.7±11.2)歲,男女性別比2∶3。患者和對照者年齡差異無統計學意義(t=0.512,P=0.552);兩組性別比差異無統計學意義(χ2=2.258，P=0.066)。本研究得到秦皇島市第一醫院倫理委員會的批準,檢查者均已簽署書面知情同意書。

1.2主要試劑和儀器PE標記的抗人CD25抗體，Alexa-fluor 488標記的抗人Foxp3抗體，PerCP-Cy5.5標記的抗人CD4抗體，APC標記的抗人CD152抗體，PE-CY7 標記的抗人CD3抗體(以上流式抗體從美國BD公司購買)，固定/打孔液從eBioscience公司購買， PI(propidium iodide)從美國Sigma公司購買淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque(1.077)從美國Sigma公司購買；臺式離心機從美國BECKMAN公司購買;FACS Fortessa流式細胞儀從美國BD公司購買；正置光學顯微鏡從日本OLYMPUS公司購買。

1.3制備外周血單個核細胞在早晨空腹采集患者及健康對照組靜脈血15 ml，放入肝素抗凝管中,放在冰盒準備分離單個核細胞。將15 ml 1×PBS稀釋外周血將其混勻，將15 ml淋巴細胞分離液加入到50 ml離心管中，然后將稀釋后的外周血輕輕加到淋巴細胞分離液上層，形成血樣和淋巴細胞分離液分層。2000 rpm，離心30 min后將中間的白膜層吸出后再次離心，分離出單個核細胞。

1.4流式細胞儀熒光抗體標記及檢測將滴定后的CD3、CD4、CD25流式抗體10 μl加入100 μl重懸的細胞中混勻，4 ℃避光孵育30 min后，加入2 ml的FACS media溶液，1400 rpm，5 min離心，棄上清后再重復洗一遍。配固定打孔工作液，加500 μl固定打孔工作液重懸細胞，4 ℃避光60 min。取1×打孔緩沖液，1650 rpm，4 ℃，離心5 min，洗兩次，棄盡上清后進行細胞內染色，取Foxp3抗體CD152抗體加至樣品流式管中，混勻，4 ℃避光孵育60 min，加入1×打孔緩沖液，1650 rpm，5 min離心棄盡上清，加打孔緩沖液300 μl/管重懸細胞。通過FACS Fortessa流式細胞儀對標記處理的細胞進行檢測，用Flowjo軟件對所得數據相應細胞表型可以進行分析。

2　結　果

2.1通過檢測調節性T細胞的Foxp3和CD152的比例表明重癥肌無力患者術前明顯低于健康人MG患者術前外周血CD4+CD25+Treg中Foxp3表達比例為(2.21±0.51)，CD152表達比例為(0.88±0.25)；健康組Foxp3表達比例為(4.58±0.88)，CD152表達比例為(3.36±1.32)。MG患者術前Foxp3和CD152表達明顯低于健康對照組，具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2重癥肌無力患者手術后外周血中調節T細胞Foxp3和CD152的水平手術后6個月MG患者外周血調節性T細胞Foxp3表達水平為3.66±1.2，CD152表達水平為2.44±1.12。與手術前相比Foxp3和CD152的表達水平明顯高于患者手術前水平，經比較具有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，手術后Foxp3和CD152水平仍低，未達到健康者水平,差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.3Foxp3與CD152比例相關性分析重癥肌無力患者外周血調節性T細胞的Foxp3與CD152呈正相關性(r=0.679，P<0.001)。

表1　各組外周血Treg 檢測結果

與術前組比較*P<0.05；與對照組比較#P<0.05

3　討　論

MG的發病與胸腺關系密切，臨床上胸腺切除的療效已得到公認。本研究50例患者合并胸腺瘤42例，胸腺增生8例，眼肌型MG28例，全身型MG22例。經過胸腺切除術后完全緩解22例，緩解20例，無效8例，總有效率為84%。

胸腺為T淋巴細胞的發育器官，MG患者胸腺內Treg數量的下降與其自身反應性T細胞的大量激活及其免疫耐受的破壞具有相關性。Foxp3主要是表達于CD4+CD25+Treg和異位表達于CD4+CD25-T細胞上，但可使CD4+CD25-T細胞轉換成Treg，因此具有兩大功能特性：免疫無能及免疫抑制[6]。所以Foxp3是影響Treg分化和功能的一種很重要的轉錄因子。有研究表明CD4+CD25+T細胞改變可能與MG患者胸腺手術狀態及疾病的進展具有相關性。Sun Y等研究表明癥狀未控制的MG患者外周血CD4+CD25+T 細胞比例明顯低于穩定期的MG患者，與此同時胸腺切除術后患者外周血CD4+CD25+T細胞比例明顯高于未手術患者和正常對照[7]。我們在研究中發現，MG患者外周血中Foxp3表達顯著低于對照組，提示Foxp3在MG發病中起重要的負性調節作用。Foxp3表達降低可以引起CD4+CD25+Treg的數量下降、功能下調，才引起機體自身免疫抑制失衡而導致MG發病。我們的研究發現胸腺切除術后CD4+CD25+T細胞較手術前明顯上升，考慮胸腺(包括胸腺瘤)切除術后，非胸腺來源的CD4+CD25+T細胞可能進入外周血維持這一細胞亞群的平衡，可能激活了外周既往存在的胸腺來源的Treg細胞的克隆擴增。

CD152(CTLA-4)細胞毒性T淋巴細胞抗原是T細胞表面表達的一類共刺激分子，在T細胞中主要表達于調節性T細胞。CD4+CD25+Treg細胞主要依賴CD152(CTLA-4)直接接觸方式介導抑制T細胞的活化和增殖[8]。CD152并不能穩定表達于細胞表面,而是貯存于Treg細胞的膜下囊泡中[9]，細胞內高表達CTLA-4是Treg細胞的表型特征之一,其表達水平能夠反映其潛在的功能狀態。有研究[10]顯示腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg免疫抑制作用增強與其胞內高表達CTLA-4有關。因此，MG患者CD4+CD25+Treg胞內CTLA-4表達量減少可能減弱了CD4+CD25+Treg潛在的免疫抑制作用,限制了其免疫負性調節能力。

Treg細胞與CD152分子都可作為削弱免疫反應的工具，無論是何種亞型或起源。Treg或CD152分子任意一種升高或者過表達，都可造成腫瘤患者的免疫抑制狀態[11]。早期研究發現，CD152和Treg在免疫調節功能上有部分重疊。占多數比例的CD152依賴性免疫反應包含了存在于Treg中CD152的活動，CD152同樣可對常規T細胞起作用。CD152反映了Treg功能的主要機制，Treg亦可作用于大量非CD152依賴的抑制性免疫機制[12]。本研究結果顯示MG患者外周血Treg細胞Foxp3和胞內CD152的表達存在正相關性,這可能由于Foxp3可能直接指導CD152表達有關。CD152可能是代表Foxp3+Treg細胞抑制活性的重要分子,但CD152和Foxp3之間的確切關系還有待于進一步研究。

綜上所述,本研究顯示胸腺切除術影響MG患者外周血中細胞免疫，尤其是提高了外周血Treg細胞比例，但這一結果受到許多因素影響，如肌無力分型、是否應使用糖皮質激素、是否合并胸腺瘤等因素影響。因此，需要擴大樣本以及細化分類等進一步研究。

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Expression and correlation of Foxp3 and CD152 in the myasthenia gravis patients’peripheral blood

ZHANGZhefeng,LIANGHuagang,XUELei,etal.

(DepartmentofThoracicSurgery,theFirstHospitalofQinhuangdao,Qinhuangdao066000,China)

ObjectiveThis study aimed to identify the results of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood after total thymectomy in patients with myasthenia gravis.MethodsWe included a total of 50 MG patients following total thymectomy.We set 25 healthy people as the control.Blood samples were selected from preoperative groups,postoperative groups and control groups.Using flow cytometry study to examine the peripheralblood and analyze the expression of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells.ResultsThe preoperative levels of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood were significantly decreased (P<0.05) compared with the healthy control.The total proportion of Foxp3 and CD152 in the postoperative group were markedly higher than that in the preoperative group(P<0.05),however,comparing to the healthy control the proportion were lower (P<0.05).We found the level of Foxp3 and CD152 were positively correlated in Tregs in myasthenia gravis patients (P<0.001).ConclusionOur report showed that myasthenia gravis patients had low expression of Foxp3 and CD152 of Tregs in peripheral blood,total thymectomy could markly increase the expression of them.Together,our research provided theoretical basis for pathogenesis of myasthenia gravis and thymectomy.

Foxp3;CD152(CTLA-4);Myasthenia gravis;Thymectomy

1003-2754(2016)02-0154-03

2015-10-12；

2015-11-28

秦皇島市科學技術研究與發展計劃項目(No.201502A086)

(河北秦皇島市第一醫院胸外科，河北 秦皇島 066000)

高鯤，E-mail：15133526006@163.com

R746.1

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