MicRNA-124可能通過PI3K/Akt通路調節缺血腦組織細胞凋亡

王長明，蔣國紅，徐　平，張金菊，劉海軍，魏志杰，張　麗

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MicRNA-124可能通過PI3K/Akt通路調節缺血腦組織細胞凋亡

王長明，蔣國紅，徐平，張金菊，劉海軍，魏志杰，張麗

目的探討腦缺血環境下對micRNA-124表達的影響。方法采用Western blot、熒光定量PCR技術檢測腦缺血后缺血皮質區不同時間點bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1、micRNA-124蛋白或基因的表達水平。 結果缺血腦組織細胞micRNA-124基因表達量與調控細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3增高一致；bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段蛋白表達量逐漸升高，在隨后觀察的時點內持續處于高表達狀態(P<0.01)。結論micRNA-124可能參與缺氧致腦組織細胞凋亡的過程，其機制可能是通過PI3K/Akt通路，激活或抑制bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1其中一個或是多個基因調節缺氧腦組織細胞凋亡。

micRNA-124；ROCK1；Western blot；熒光定量PCR；細胞凋亡

腦缺血性卒中患者大量腦神經元因缺血缺氧損傷發生不可逆性的變性壞死，大腦局部缺血時導致多種micRNAs的表達發生異常改變，這些micRNAs水平的改變可影響其靶基因的表達。腦缺氧環境刺激micRNA-124表達上調，而micRNA-124與磷酯酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3Ks)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB也被稱作Akt)通路關系密切，PI3K/Akt通路具有調節細胞增殖、分化和凋亡的作用。目前micRNA-124對缺血腦卒中神經元凋亡及再生的調控機制不明，本研究通過構建大鼠腦缺血模型，檢測腦缺血后缺血皮質區不同時間點micRNA-124及可能靶基因bax、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia2，bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)、Rho相關的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)中ROCK1的表達水平，探討腦缺血環境下對micRNA-124表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠35只，體重(200±20)g(中山大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK粵監2011-0029)；數碼凝膠圖像分析系統，LG2000，杭州朗基科學儀器有限公司。電泳、電轉系統，Mini型蛋白電泳系統(小型全套蛋白電泳系統)Bio-rad(美國伯樂)。Goat anti-rabbit IgG-HRP和Goat anti-mouse IgG-HRP購自SANTA CRUZ。熒光定量儀ABI 7300，SYBR Premix EX Taq ⅡKit TaKaRa(RR820A)，PrimeScript TMRT reagent Kit TaKaRa(RR047A)。

1.2研究方法

1.2.1MCAO模型的制作、鑒定與分組參照改良的Longa 等方法制作MCAO模型。分為正常組、假手術組、灌注組1 d、灌注組3 d、灌注組7 d(每組7只大鼠)。假手術組大鼠僅游離血管，其它同缺血組大鼠。取缺血后1 d SD大鼠腦組織行TTC染色。SD大鼠MCAO模型麻醉清醒后出現左側肢體神經功能缺損和右側出現Horner征者表明模型制作成功，Zea longa評分1～3分者選為實驗研究對象。

1.2.2Western blot技術檢測ROCK1的蛋白表達用RIPA法提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(按1∶4的比例)，100 ℃煮沸5～10 min。-20 ℃保存備用。用SDS-PAGE蛋白分離，蛋白轉印到硝酸纖維素膜，轉膜后所有蛋白用5%的脫脂奶粉封閉，室溫封閉1～2 h或4 ℃封閉過夜。孵育一抗，根據所需抗體濃度，用TBST稀釋(目的蛋白bax：1∶2000；bcl-2：1∶1000;caspase-3：1∶400)。4 ℃孵育過夜。孵育二抗，根據所需抗體濃度，用TBST稀釋，室溫孵育2 h左右(二抗所用濃度均為1∶5000)。用ECL顯色試劑盒顯色，在暗房中觀察熒光的明亮度確定曝光的時間，洗片進行顯影和定影。結果用LabWor 3.0 UVP軟件，以目的條帶與β-actin的灰度值進行分析。

1.2.3熒光定量PCR檢測bax、bcl-2、caspase-3、micRNA-124基因表達(1)引物設計合成：GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區設計特異性引物：bcl-2：Forward Primer：5’-GGCATCTGCACACCTGGAT-3’，Reverse，Primer:5’-ATCAAACAGAGGTCGCATGCT-3’；bax：Forward Primer:5’-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3’，Reverse Primer:5’-TCTCCCCAGCCATCCTCTCT-3’；caspase-3：Forward Primer:5’-AGTGGAGGCCGACTTCCTGTA-3’，Reverse Primer:5’-TGGCGCAAAGTGACTG；micR-124：RT Primer：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCATT-3’;Forward Primer：5’-AGCTCGTAAGGCACGCGGT-3’，Reverse primer：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH(內參)：Forward Primer:5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3’，Reverse Primer:5’-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3’；U6(內參)：Forward Primer：5’-TGACACGCCACTTCAGCAA-3’，Reverse Primer：5’-CTTCAGCTTCTCTGCCTCCAG-3’。(2)組織RNA的提取：取適量組織至1.5 ml EP管中，用剪刀剪碎組織加Trizol 1 ml后用玻璃棒研磨，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。加入氯仿0.2 ml ，蓋緊蓋子，用振蕩器振蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4 ℃ 12000 r/min 離心15 min，取上清液至新的1.5 ml Eppendorf 管，加與上清液等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃孵育樣品20～30 min，4 ℃ 12000 r/min 離心10 min，棄上清液。75%乙醇(含DEPC水)800 μl洗滌沉淀一次，4 ℃ 7500 r/min 離心5 min，棄乙醇。空氣或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)，加DEPC處理水20～50 μl溶解RNA，-80 ℃保存備用。若長期保存，加入2.5倍體積乙醇，置-80 ℃保存。純度檢測：取1 μl RNA樣品50倍稀釋，在島津(日本)UV-1750紫外分光光度儀上測定OD值，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。總RNA完整性檢測：挑5例取RNA樣品1 μl，1%瓊脂糖凝膠電泳80 V×20 min，用凝膠成像系統觀察總RNA的5 s rRNA、18 s rRNA和28 s rRNA條帶，3條條帶完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。(3)逆轉錄反應：取4 μl RNA模板做逆轉錄反應，儀器為BIO-RAD定性PCR儀，反應體系RNase Free dH2O 10 μl，5×Prime ScriptTM Buffer (for real time)2 μl，PrimeS，criptTM RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligod T Primer(50 μmol)1 μl，Random 6 mers (100 μmol) 2μl，RNA 4 μl，總體積20 μl。MicRNA124逆轉錄RNase Free d H2O 12.5 μl，5×Prime ScriptTM Buffer (for real time)2 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μl(非MicRNA124)。MicRNA124：RT Primer：(10 pmol/μl)0.5 μl，RNA 4 μl，總體積20 μl。反應條件：37 ℃ 15 min，然后85 ℃ 5 s。(4)熒光定量PCR反應：反應體系：H2O 6.8 μl，SYBR?Premix Dimer Eraser(2×)10 μl，Forward Primer (10 pmol/μl) 0.6 μl，Reverse Primer (10 pmol/μl)0.6 μl，cDNA2 μl，總體積20 μl。

2　結　果

2.1MCAO模型的制作SD大鼠MCAO模型麻醉清醒后，左側肢體神經功能缺損和右側出現Horner征者表明模型制作成功，Zea longa評分1～3分者選為實驗研究對象。取缺血后1 d SD大鼠腦組織行TTC染色(見圖1)。

2.2熒光定量PCR檢測micRNA-124基因表達熒光定量PCR (SYBR Green法)檢測大鼠缺血腦組織bax、bcl-2、caspase-3、miR-124基因表達。腦缺血組織bax、bcl-2、caspase-3基因表達量第一天逐漸升高，3 d達高峰。miR-124基因表達量與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3變化基本一致，也是第一天逐漸升高，3 d達高峰。與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.01)(見圖2、圖3)。

2.3Western blot技術檢測ROCK1的蛋白表達根據WB圖譜分析，內參蛋白和目的蛋白都有條帶。bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段在缺血再灌注1 d后逐漸升高，在隨后觀察的時點內持續處于高表達狀態，與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.01)，ROCK1與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3變化一致(見圖4)。

圖1　A模型組　　　　　B手術組

圖2　micRNA-124樣本擴增曲線圖

注釋：Ct值是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數;每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小

圖3　MicRNA-124基因相對表達量

圖4bax、bcl-2、baspase-3、ROCK1的蛋白表達(正常組、假手術組灌注組1 d、灌注組3 d、灌注組7 d)

3　討　論

MicRNA是一類高度保守非編碼RNA分子，長度大約為18-22個堿基對。盡管目前只發現了數百種micRNA，但每種micRNA都可能調節數百個靶基因，人類超過1B(billion)的基因可能由micRNA調控。micRNA在神經系統中大量表達，腦組織中特有的micRNA包括micRNA-9、micRNA-124a、micRNA-124b、micRNA-135、micRNA-153、micRNA-183和micRNA-219等[1]。Lagos-Quintana M等研究micRNAs表達的組織特異性時發現micRNA-101、124、127、128、131和132在小鼠腦組織中特異性表達，其中micRNA-124表達最為明顯，在大腦皮質中腦和小腦中特異性表達均高，約占腦部總micRNAs的25%～48%，在中樞神經系統(central nervoussystem，CNS)中的表達量比其他組織高100多倍[2]。多種micRNAs在腦組織中高度表達，這些micRNAs可能與腦組織的發育、神經元的分化及高級神經功能的行使等密切相關[3]。

腦缺血后眾多與NSCs增殖分化相關的特異micRNAs表達水平也發生急劇的變化，提示micRNAs可能也參與了腦缺血后NSCs增殖分化過程的調控。但哪些特異micRNAs參與調控及如何調控腦缺血后的NSCs增殖分化過程并不完全清楚。micRNA-124是CNS中含量最多的一種micRNA[4]，micRNA-124的高表達提示其在中CNS中有著極其重要的作用，因此micRNA-124成為分子生物學和神經生物學最受關注的micRNA之一[5]。micRNA-124在缺血性腦卒中通過影響氧和葡萄糖剝奪而誘發細胞凋亡[6]。近來也有學者在局限性腦缺血的大鼠模型上發現，micRNA-124可以在缺血區通過調節Ku70mRNA和其蛋白水平從而促進腦缺血/再灌注后腦的損傷和功能障礙[7]。

PI3K/Akt信號通路是細胞內重要存活和抗凋亡的信號轉導通路。PI3K是一類脂性激酶，PI3K家族與細胞增殖、抗凋亡、細胞遷移、膜泡轉運、細胞癌性轉化等眾多過程相關，這些生物效應主要是通過PI3K催化形成的“錨”分子3-磷酸肌醇脂(PIP、PIP2、PIP3)介導。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的Akt通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等進而調節細胞功能。Akt的磷酸化激活主要依賴PI3K的活化，活化的Akt通過磷酸化和純化其下游底物，經由多種途徑而促進細胞的存活。腦損傷后多種神經營養因子通過激活PI3K/Akt信號途徑發揮腦保護作用。研究表明在成年兔腦組織中Akt有微量表達，創傷性腦損傷后1 h p-Akt表達開始增加，在損傷皮質邊緣區其免疫反應性增強[8]，全腦組織中p-Akt區域表達的差異可能導致細胞損傷程度的不同。提示PI-3K/Akt信號通路參與調控了創傷性腦損傷后的病理過程。

腦缺氧環境刺激micRNA-124表達上調，而micRNA-124與PI3K/Akt通路關系密切，PI3K/Akt通路具有調節細胞增殖、分化和凋亡的作用。目前micRNA-124對缺血腦卒中神經元凋亡及再生的調控機制不明。本研究通過構建大鼠腦缺血模型，熒光定量PCR檢測大鼠缺血腦組織bax、bcl-2、caspase-3、micRNA-124基因表達。結果顯示腦缺血組織bax、bcl-2、caspase-3基因表達量第一天逐漸升高，3 d達高峰。micRNA-124基因表達量與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、baspase-3變化基本一致，亦在第1天逐漸升高，3 d達高峰；Western blot技術檢測bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1的蛋白表達，結果表明bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段在缺血再灌注1 d后逐漸升高，在隨后觀察的時點內持續處于高表達狀態，與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.01)。

bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1均為細胞凋亡調控基因。bcl-2作為抗凋亡基因、bax作為促進凋亡基因，都可作為caspase-3的上游調控基因，bcl-2、bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調控因素，其過度表達能活化下游caspase-3蛋白酶，介導細胞的存活或死亡。ROCK可以被caspase-3激活，ROCK1是活化的caspase-3的直接裂解底物，而激活的ROCK1又可以反饋激活caspase-3。MicRNA-124與細胞凋亡基因一樣在缺血腦組織中表達明顯增高，表明micRNA-124可能參與了缺氧致腦細胞凋亡的過程，其機制可能是通過PI3K/Akt通路。激活或抑制bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1其中一個或是多個基因，在缺氧腦組織細胞凋亡中起調節作用。但其在該過程中是抗凋亡或是促進細胞凋亡，以及具體調控靶基因及機制需要我們進一步深入研究探討。

[1]Gao FB.Posttranscriptional control of neuronal development by microRNA networks[J].Trends Neurosci,2008,31(1):20-26.

[2]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9):735-739.

[3]Yu JY,Chung KH,Deo M,et al.MicroRNA miR-124 regulates Neurite out growth during neuronal differentiation[J].Expcell Res,2008,314(14):2618-2633.

[4]Akerblom M,Sachdeva R,Barde I,et al.MicroRNA-124 is a subventricular zone neuronal fate determinant[J].J Neurosci,2012,32(26):8879-8889.

[5]Gao FB.Context-dependent functions of specific microRNAs in neuronal development[J].Neural Dev,2010,5:25.

[6]Sun Y,Gui H,Li Q,et al.MicroRNA-124 protects neurons against apoptosis in cerebral ischemic stroke[J].CNS Neurosci Ther,2013,19(10):813-819.

[7]Zhu F,Liu JL,Li JP,et al.MicroRNA-124(miR-124) regulates Ku70 expression and is correlated with neuronal death induced by ischemia/reperfusion[J].J Mol Neurosci,2014,52(1):148-155.

[8]Zhao S,Fu J,Liu X,et al.Activation of Akt/GSK-3beta/beta-catenin signaling pathway is involved in survival of neurons after traumatic brain injury in rats[J].Neurol Res,2012,34(4):400-407.

MicRNA-124 may regulating hypoxia brain cells apoptosis through PI3K/Akt pathway

WANGChangming，JIANGGuohong,XUPing,etal.

(DepartmentofNeruology,1stAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

ObjectiveTo explore micRNA-124 expression under the condition of cerebral ischemia.MethodsUsing Western blot and fluorescence quantitative PCR technique to detect bax,bcl-2,caspase 3,ROCK1,micRNA-124 protein or gene expression of ischemic cortex at different time points after cerebral ischemia.ResultsGene expression of MicRNA-124 with bax,bcl-2,caspase-3 increased consistently；bax,bcl-2,caspase-3 and ROCK1 segments of activated protein expression quantity increased.In the subsequent observation point inside the continued at a high expression.ConclusionMicRNA-124 may be involved in the process of anoxia brain tissue cell apoptosis,its mechanism may be through PI3K/Akt pathway to activate or inhibit bax,bcl-2,caspase-3,ROCK1 one or multiple genes,regulating cell apoptosis of the anoxia brain tissue.

micRNA-124；Western blot；ROCK1；Luorescence quantitative PCR；Cell apoptosis

1003-2754(2016)02-0146-04

2015-12-04；

2016-01-30

遵義市科技計劃，遵市科合社字(2014,No.78)

(遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563003)

蔣國紅，E-mail：421855696@qq.com

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