阿爾茨海默病患者血清中microRNAs表達譜的研究

曾慶宏，劉　霞，周　芳，聶紅霞，于善花，姜建東，王傳淇，彭艷艷，張浩江，莊愛霞

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阿爾茨海默病患者血清中microRNAs表達譜的研究

曾慶宏1，劉霞2，周芳1，聶紅霞1，于善花1，姜建東1，王傳淇1，彭艷艷1，張浩江1，莊愛霞1

目的探討阿爾茨海默病(AD)患者血清中microRNAs與阿爾茨海默病之間的關系，尋求一種可能作為輔助診斷AD的早期生物標志物。方法研究對象分為AD組和對照組，分別取其血清并提取microRNAs，利用microRNA基因芯片檢測出表達差異的microRNAs，并用實時熒光定量PCR(QT-PCR)的方法進行驗證。 結果基因芯片篩選出43個與AD相關的差異表達microRNAs(P<0.05),其中microRNA-107及microRNA-222的表達水平在AD患者中均顯著低于對照組(P<0.01)，與QT-PCR驗證結果一致。結論MicroRNA-107及microRNA-222可能通過多種途徑影響AD的發生發展，有望成為一種輔助診斷AD的早期生物標志物。

阿爾茨海默病；microRNAs；microRNA-107；microRNA-222

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經退行性疾病，表現為認知、語言、記憶等功能障礙[1，2]，日常生活能力進行性減退，并可伴有各種神經精神癥狀和行為障礙，是導致老年人癡呆的主要原因。近年來一些新技術的開發應用，促進了蛋白組學的研究，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MSS)[3],高效液相色譜與電感藕合等離子質譜(HPLC-ICP-MS)[4]，液相色譜-紫外光譜-質譜聯用技術(HPLCUV-MS)[5，6],鳥槍法蛋白質組學[7]等對蛋白的分離、定性和定量的檢測，可能有助于新的AD生物標記物的發現，但仍缺乏特異性和敏感性均高的單一的診斷方法。

microRNA是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的單鏈非編碼小分子RNA，主要功能是通過抑制靶mRNA翻譯或促使其降解的方式對基因表達起調控作用[8]，參與細胞周期調控及個體發育過程[9]。在神經系統中microRNA調節不同發育階段及不同部位的病生理條件下神經細胞的增殖、分化與凋亡，并對人類的認知和記憶能力的形成起重要作用[10，11]。大量研究表明，血清中存在著穩定的microRNAs表達[12，13]。本研究利用μParaflo微流體芯片技術檢測了AD患者與健康體檢者血清中的microRNAs，并用QT-PCR方法進行驗證，發現了與AD密切相關的microRNAs，有望成為AD的生物學診斷和判斷預后的重要指標。

1　材料與方法

1.1研究對象(1)AD組：選取2013年6月-2015年6月在我院住院及門診就診首次診斷AD的患者30例；(2)設年齡相匹配的對照組：為正常健康體檢者30例，具有正常功能活動能力，無器質性腦病，神經系統檢查無異常，MMSE評分在28分以上。排除標準:(1)既往有腦血管疾病者；(2)有顱腦外傷者；(3)有中毒性、代謝性等腦病者；(4)診斷前進行藥物治療者；(5) 有血液系統疾病者；(6)血管性及其他原因所致癡呆；(7)未知情同意者。

1.2診斷標準阿爾茨海默病診斷標準根據2011年美國國家衰老研究所(National Institute of Aging,NIA)和阿爾茨海默病學會(Alzheimer’s Association,AA)制定的診斷標準(NIA-AA診斷標準)。簡易智能精神狀態量表(MMSE)評分標準：文盲組≤17分，小學組≤20分，中學組≤22分，大學組≤24分。

1.3方法

1.3.1資料收集記錄所有研究對象的性別、年齡、既往史(高血壓、糖尿病、冠心病等)、吸煙史、飲酒史以及纖維蛋白原、高半胱氨酸、C-反應蛋白、血脂等指標。

1.3.2樣本采集AD組治療前采取靜脈血5 ml，對照組靜脈血來自體檢中心體檢者，所有靜脈血提取血清后放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3總RNA提取取100～200 μl低溫冷藏的每例血清樣本，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的Trizol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進行變性處理。按等體積加入氯仿，振蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4 ℃條件下，14000 r/min離心15 min抽提RNA。

1.3.4芯片檢測抽取每例AD組患者的2 μg總RNA，充分混勻后抽提RNA。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3’端加上Poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個Poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續的熒光標記。雜交反應利用微循環泵的循環作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行。在微流體芯片上，每條檢測探針都是由一個化學修飾核苷酸編碼段或是與其他RNA和一個由聚乙二醇組成的間隔段組成。檢測探針均使用PGR(PhotoGenerated Rea-gent)化學法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學修飾檢測探針進行平衡。RNA與探針雜交后，與標記特異結合的Cy3和Cy5染料在微流體芯片上循環流動進行染色。利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數字化轉換。數據分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾(Locally-Weighted Regression)進行信號歸一化。計算兩種檢測信號的比值(log2轉換)和t-test的P值。值<0.05的數據為差異性表達數據。

1.3.5逆轉錄用Taqman microRNA逆轉錄試劑盒和microRNA特異性莖環結構逆轉錄引物進行microRNA逆轉錄反應，操作按照ABI的流程，進行部分調整，總反應體系15 μl。

1.3.6QT-PCR檢測根據芯片結果分別設計引物序列，以U6 snRNA作為內參，應用QT-PCR把兩組患者的表達異常的microRNA進行定量分析，然后進行相互比較。用2-ΔΔCt計算microRNA的表達量,每例樣本重復檢測3次。

2　結　果

2.1一般資料結果AD組30例，男11例，女19例，平均年齡(63.3±11.5)歲；對照組30例，男13例，女17例，平均年齡(62.1±10.6)歲。兩組在性別、年齡及常見危險因素方面差異無統計學意義，具有可比性(見表1)。

2.2基因芯片檢測結果AD組檢測出信號表達大于500的差異microRNAs43條(P<0.05)，對差異表達microRNAs的信號比值進行聚類，可分為上調組和下調組，其中與對照組相比上調33條，下調10條(見圖1)。

2.3MicroRNA-107QT-PCR結果選取芯片檢測結果中差異表達有統計學意義的microRNA-107，進行QT-PCR驗證。AD組患者血清中microRNA-107較對照組下調(P<0.01)，與芯片結果一致(見表2、圖2、圖3)。

2.4MicroRNA-222QT-PCR結果選取芯片檢測結果中差異表達有統計學意義的microRNA-222，進行實時熒光定量PCR 驗證。AD組患者血清中microRNA-222明顯下調(P<0.01)，與芯片結果一致(見表3、圖4、圖5)。

表1　 兩組一般資料對比

表2　兩組microRNA-107定量結果

ΔCt表示同一個樣品目標基因和內參基因平均Ct值的差值;ΔΔCt表示特定目標基因的待檢樣品和校準樣品ΔCt的差值

表3　兩組microRNA-222定量結果

圖1　AD組與對照組差異microRNA聚類圖

圖2　microRNA-107擴增曲線及溶解曲線圖

圖3　以M為校準U6為內參microRNA-107基因表達水平

圖4　microRNA-222擴增曲線及溶解曲線

圖5　以M為校準U6為內參microRNA-222基因表達水平

3　討　論

近年來的研究表明，microRNAs與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、人類遺傳性疾病、神經系統疾病的發生發展密切相關。存在于腦部的microRNAs大約有20%～40%對腦的生長發育發揮著重要調控作用，甚至直接參與了哺乳動物神經細胞分化以及突觸的形成。還有些microRNAs在神經退行性疾病中發揮著重要的作用[14]。Hebert等在AD的轉基因小鼠模型里檢測到對AD的影響microRNAs[15]。已有多項研究表明，microRNAs在細胞實驗中能調節淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的表達[16，17]及影響Aβ沉積[18]。某些microRNAs促進了Aβ產生，Aβ又可改變microRNAs表達，成為microRNAs網絡失衡的始發因子[19]，microRNAs與Aβ之間存在一種極其復雜的聯系，在體內相互促進相互影響，從而影響著AD的發生發展。MicroRNA-125b被證明可引起tau蛋白高度磷酸化，其機制在于靶向抑制磷酸酶DUSP6(dual-specificity phosphatases 6)和PPPlCA而促進tau蛋白磷酸化，研究同時發現miR-125b可損害小鼠聯合型學習[20]。可見，microRNAs從多種機制上參與了AD的發生。

目前有關microRNAs在AD患者中的研究少見報道，本研究通過生物芯片技術檢測了AD患者與正常健康體檢者血清中microRNAs的表達，結果表明有多種microRNAs表達差異有顯著性。AD組檢測出信號表達大于500的差異microRNAs43條，很多具有差異的microRNA在以往均少見相關研究報道，特別是差異較大的microRNA-4267、microRNA-30c-1-3p、microRNA-3197、microRNA-6820-5p、microRNA-6865-5p、microRNA-1910-3p等，這些microRNAs在AD發生發展中所起的作用還需要進一步的研究。

根據芯片結果，選取表達差異的microRNA-107采用QT-PCR進行驗證，證實與芯片結果一致。本研究QT-PCR結果表明AD組患者血清中microRNA-107較對照組下調(P<0.01)。 microRNA-107隸屬于microRNA-107/103家族，與AD的發生相關[21]，Nelson發現AD和輕度認知功能障礙的患者中microRNA-107表達水平下降[22]，與本研究結果一致。microRNA-107可能通過以下相關機制影響AD的發生發展。首先，Wang等[23]對不同階段AD患者腦組織中的RNA進行分析，發現AD進程中miRNAl07的表達出現不同程度減少，而淀粉蛋白前β位分解酶1(BACEl)表達增加，從而出現相應的病理改變，該研究認為miRNA107可通過與靶基因BACEl的3’端UTR區結合調控BACEl的表達，繼而增加APP水解后Aβ生成與沉積導致AD的發生，并可能通過調節BACE1參與加速該病的進展；其次，microRNA-107也可以誘導神經元細胞周期阻滯[24]，并重新進入細胞周期，重新進入細胞周期是AD發病的早期事件甚至發生在Aβ和神經元纖維纏結(NFTs)形成之前[25]，導致AD的發生。當然，microRNA-107影響AD的機制還需要進一步的研究。

QT-PCR結果表明AD組患者血清中microRNA-222明顯下調(P<0.01)，與芯片結果一致。眾所周知，P27kipl是一種細胞周期依賴性激酶抑制因子，參與AD的發生、發展。Wang等觀察AD模型小鼠并與年齡匹配的對照組相比發現，AD模型小鼠microRNA-222表達下調，與p27kip1蛋白水平升高相關，從而指出microRNA-222正是通過影響AD的細胞周期失調及p27kip1的表達而參與發病[26]。Zhang等[27]通過原位雜交與免疫組化檢測，發現microRNA-222高表達的樣本中有81%出現了PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)的表達水平降低(P<0.001)，與此同時在microRNA-222下調的樣本中有79%檢測出了PUMA的高水平表達。PUMA是2001年由Yu等人發現的一個新bcl-2家族成員，其中PUMA-α和PUMA-β因含有BH3結構域而受到了廣泛的研究，該結構域是PUMA蛋白與bcl-2家族其它成員相互作用，發揮促進神經細胞凋亡作用的關鍵因素，調控bcl-2基因的表達可參與AD的發病。已有的研究也表明，PUMA誘導細胞凋亡包括了p53依賴性凋亡通路和p53非依賴性凋亡通路，兩條通路最終都通過誘導線粒體膜電位改變，引起細胞色素C等凋亡信號因子的釋放，進而激活caspase-3和caspase-9最終導致細胞凋亡，caspase-3和caspase-9水平增加增強表達,從而導致AD的發生。Ok等的研究證實，caspase介導的APP切割產物與Aβ共定位于AD老年斑中，caspase在調節神經毒性Aβ的生成及在AD神經元最終的凋亡中有著極其重要的作用。microRNA-222參與AD的發病也與其在海馬區域中的含量相比于其他區域特異性要高有關。結合本研究結果，血清中microRNA-107、microRNA-222可能間接反映腦組織內的microRNA-107、microRNA-222表達變化，但AD患者血清中表達水平下降的原因和機制尚需進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示microRNA-107、microRNA-222在AD患者中的表達量顯著降低，可能作為AD的一種潛在的生物標志物，并且可能成為治療靶點，但microRNA-107、microRNA-222表達水平與AD的診斷是否具有特異性，尚需進一步擴大樣本量進行驗證。

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Study on microRNAs expression in serum of patients with Alzheimer’s disease

ZENGQinghong,LIUXia,ZHOUFang,etal.

(DepartmentofNeurology,TheSecondPeople’sHospitalofLianyungang,Lianyungang22206,China)

ObjectiveTo explore the relationship between microRNAs and Alzheimer’s disease in serum of patients with Alzheimer’s disease,in order to find an early biomarker for diagnosis of AD.MethodsThe study subjects were divided into AD group and control group.MicroRNAs was extracted from serum.The expression of microRNAs was detected by microRNA gene chip,and the method was verified by fluorescence quantitative PCR.Results43 AD related genes were selected to screen the differentially expressed microRNAs gene (P<0.05),and the expression level of microRNA-107 and microRNA-222 was significantly lower in AD patients than in control group (P<0.01),and the results were consistent with gene chipQT-PCR.ConclusionMicroRNA-107 and microRNA-222 may influence the occurrence and development of AD in many ways,which is expected to be an early biomarker for the diagnosis of AD.

Alzheimer’s disease；microRNAs；microRNA-107;microRNA-222

1003-2754(2016)02-0123-05

2015-12-15；

2016-01-29

連云港市科技局課題基金(SH1224)

(1.連云港市第二人民醫院神經內科，江蘇 連云港 222006；2.連云港市第二人民醫院檢驗科，江蘇 連云港 222006)

莊愛霞,E-mail：aixiazhuang1965@sina.com

R749.1

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