西達本胺聯合姜黃素對人皮膚T細胞淋巴瘤細胞系Hut78的影響及其分子機制

谷曉廣 吳芳妮 張芊 張春雷100191北京大學第三醫院皮膚科

西達本胺聯合姜黃素對人皮膚T細胞淋巴瘤細胞系Hut78的影響及其分子機制

谷曉廣 吳芳妮 張芊 張春雷100191北京大學第三醫院皮膚科

目的 研究西達本胺聯合姜黃素對皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，探討西達本胺聯合姜黃素治療CTCL的機制。方法 分別用0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L西達本胺，10 μmol/L姜黃素，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素處理Hut78細胞24、48、72 h后，采用MTS法檢測Hut78細胞的生存率。用0.6、1.2 μmol/L西達本胺，10 μmol/L姜黃素，1.2 μmol/L西達本胺聯合 10 μmol/L姜黃素分別處理Hut78細胞24 h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況及細胞周期，用實時PCR和Western印跡法檢測凋亡相關基因Fas、caspase 8、NF-κB p65及細胞周期相關基因P21、CDK2、細胞周期蛋白E（cyclin E）mRNA和蛋白的表達。統計分析采用重復測量方差分析、單因素方差分析和LSD-t檢驗。結果 西達本胺能明顯抑制Hut78細胞的增殖，且呈劑量依賴性（F=266.558，P＜0.001）和時間依賴性（F=564.966，P＜0.001）。培養 48 h和72 h時，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素對細胞增殖的抑制作用顯著強于1.2 μmol/L西達本胺及10 μmol/L姜黃素（均P＜0.001）。流式細胞儀結果顯示，聯合組的凋亡細胞比例均顯著高于0.6、1.2 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。此外，聯合組和1.2 μmol/L西達本胺組G0/G1期細胞比例明顯高于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組，而其S期細胞比例及G2/M期細胞比例均明顯低于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.05），聯合組與1.2 μmol/L西達本胺組各細胞周期比例差異均無統計學意義（均P＞0.05）。實時PCR結果顯示，聯合組和1.2 μmol/L西達本胺組Fas、caspase 8、P21 mRNA的表達均明顯高于 0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001），而其 NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表達均明顯低于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。聯合組Fas mRNA的表達明顯高于 1.2 μmol/L 西達本胺組（P＜0.001），而 caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA 的表達與1.2 μmol/L西達本胺組差異無統計學意義（均P＞0.05）。Western印跡結果顯示，聯合組與0.6、1.2 μmol/L西達本胺、不加藥物的對照組比較，Fas、caspase 8、P21蛋白的表達明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE 蛋白的表達明顯降低，與以上基因mRNA的表達一致。結論 西達本胺通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡來抑制CTCL細胞系Hut78生長，聯合姜黃素能明顯提高抑制CTCL細胞系Hut78的生長率。

淋巴瘤，T細胞，皮膚；姜黃素；細胞增殖；細胞凋亡；西達本胺；Hut78細胞

皮膚T細胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）是原發于皮膚的T淋巴細胞克隆性增生造成的疾病，其中蕈樣肉芽腫（MF）和Sézary綜合征（SS）是最常見的類型。但目前CTCL的治療方法十分有限，特別是進展為腫瘤期MF及病變擴散累及周圍淋巴結和內臟器官，局部治療只能緩解癥狀，系統性化療也很難達到治愈［1-2］。西達本胺是我國具有自主知識產權和全新化學結構的選擇性組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDAC inhibitor，HDAC-I），特異性地針對與腫瘤發生和發展高度相關的第Ⅰ大類組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的亞型，主要抑制HDAC2 和HDAC3［3］，具有高抗癌活性和低毒性。姜黃素在很多腫瘤細胞系和動物模型中可抑制細胞生長和誘導凋亡。近年來的研究顯示，姜黃素能明顯誘導CTCL細胞系的凋亡并抑制其增殖［4］。本研究通過觀察西達本胺和姜黃素對CTCL細胞系Hut78增殖和凋亡的影響，檢測Hut78細胞周期和凋亡相關基因的表達，探討西達本胺聯合姜黃素治療CTCL的分子機制。

資料和方法

一、資料及試劑

Hut78細胞系（ATCC號 TIB-161），RPMI 1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司），西達本胺（深圳微芯生物科技有限公司，批號H20140129），姜黃素（美國Sigma公司，批號C7727）。MTS細胞增殖檢測試劑盒（美國Promega公司），cDNA合成試劑盒（立陶宛Fermentas公司），FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒（美國CA公司），PI試劑盒（美國BD公司），兔抗人多克隆抗體Fas、兔抗人多克隆抗體caspase 8、兔抗人多克隆抗體NF-κB p65、鼠抗人單克隆抗體P21、鼠抗人單克隆抗體CDK2、兔抗人單克隆抗體GAPDH（美國Abcam公司），細胞培養箱（美國Thermo公司）。

二、細胞培養

Hut78細胞在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基，37℃5%CO2孵育箱中培養傳代，取對數生長期不同濃度細胞進行后續試驗。

三、MTS法檢測細胞增殖

取對數生長期Hut78細胞（2×104/ml）接種于6孔板中，每孔1 ml。以西達本胺在人體內的峰濃度1.2 μmol/L 為基點［5］，通過倍比稀釋和倍比增加，實驗組分別每孔加入 0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L 西達本胺，10 μmol/L 姜黃素，1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素（聯合組），對照組加入 DMSO，每孔 10 μl，分別培養 24、48、72 h。在每個時間點混勻細胞，取100 μl細胞混懸液至96孔板中，每個濃度做3個復孔，每孔中加20 μl預先配置的MTS溶液，37℃孵箱中孵育2 h，在分光光度儀490 nm處測定吸光度（A值），重復測定3次。

四、流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期

取對數生長期Hut78細胞（2×104/ml）接種于6孔板中，每孔1 ml。實驗組分別每孔加入0.6、1.2 μmol/L西達本胺，10 μmol/L 姜黃素，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素（聯合組），對照組加入 DMSO，每孔 10 μl，培養 24 h。

細胞凋亡的檢測：每個濃度組計數5×105個細胞，以冷的PBS緩沖液清洗細胞2次，將106/ml細胞重懸在結合緩沖液中。取100 μl細胞懸液轉移到5 ml培養管中，每管中加入FITC偶聯的AnnexinV 5 μl以及 PI 5 μl。混勻細胞，避光孵育 15 min。每管中加入400 μl結合緩沖液，1 h內用流式細胞儀檢測。采用FlowJo 8.0軟件分析，計算FITC陽性細胞百分比。重復測定3次，取平均值。

細胞周期檢測：每個濃度組計數106個細胞，離心并將其重新混懸在0.3 ml PBS緩沖液中。向細胞中逐滴加入0.7 ml冰無水乙醇以固定細胞，同時不斷振蕩混勻，置冰上1 h。1 200×g離心5 min去除固定液，用冰PBS緩沖液沖洗細胞2次。將細胞重新溶于500 μl PI溶液中，在室溫下避光孵育60 min。加入3 ml PBS緩沖液，室溫下1 200×g離心5 min。將上清液小心移除，并將細胞重新混懸在500 μl PBS中。用流式細胞儀PE/PI通道進行分析，計算G0/G1期、S期和G2/M期細胞所占的比例。重復測定3次，取平均值。

五、實時PCR檢測細胞凋亡及細胞周期相關基因mRNA的表達

分別取 0.6、1.2 μmol/L 西達本胺組，10 μmol/L姜黃素組，聯合組及對照組培養24 h的Hut78細胞4×105個，離心棄上清液，加入Trizol?Reagent提取細胞RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，加入相應目的基因的引物，各引物序列見表 1。采用powerSYBR?GreenPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR，同時擴增GAPDH基因作為定量PCR的內參對照。各目的基因mRNA的表達值=（目的基因Ct值-內參基因Ct值）/內參基因Ct值×104，每個樣本分別重復3管，取均值為最終結果。

表1 凋亡相關基因Fas、NF-κB p65、caspase 8，細胞周期相關基因P21、CDK2、CyclinE和內參GAPDH的引物序列

六、Western印跡法檢測細胞凋亡及細胞周期相關蛋白的表達

分別取 0.6、1.2 μmol/L 西達本胺組，10 μmol/L姜黃素組，聯合組及對照組培養24 h的Hut78細胞107個，離心棄上清液，用PBS洗滌細胞2次，加入蛋白裂解液，混勻。4℃振蕩孵育1 h，4℃18 000×g離心10 min。收集上清液，采用BSA法蛋白定量試劑盒，對待測蛋白進行蛋白定量。取一定體積的總蛋白，加入5×蛋白電泳上樣緩沖液，充分混勻后，水浴99℃變性5min。加樣孔注入等量20μg總蛋白和5 μl marker，80 V 恒壓 30 min 后，120 V 恒壓 SDSPAGE電泳90 min。200 mA 120 min將電泳條帶電轉印到PVDF膜上，5%BSA封閉1 h后，分別加入一抗1∶1 000稀釋兔抗人Fas多克隆抗體、1∶800稀釋兔抗人caspase8多克隆抗體、1∶800稀釋兔抗人NF-κB p65多克隆抗體、1∶1 000稀釋鼠抗人P21單克隆抗體、1∶1 000稀釋鼠抗人CDK2單克隆抗體、1∶1 000稀釋兔抗人GAPDH單克隆抗體4℃過夜。TBST洗滌后加入1∶2 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，室溫孵育0.5 h，TBST漂洗，加入顯色底物顯色3 min。

圖1 西達本胺和姜黃素單用或聯合對Hut78細胞體外增殖的影響 24、48、72 h，與對照組相比，各濃度西達本胺組、姜黃素組和西達本胺聯合姜黃素組的細胞增殖均有不同程度降低，西達本胺聯合姜黃素組對細胞增殖的抑制作用最強。24 h時，聯合組對細胞的增殖抑制作用與1.2 μmol/L西達本胺組相比，差異無統計學意義，但在48、72 h時，聯合組比1.2 μmol/L西達本胺組對細胞的增殖抑制明顯加強

七、統計學分析

結 果

一、西達本胺和姜黃素對Hut78細胞體外增殖的影響

如圖 1所示，與對照組相比，0.3、0.6、1.2、2.4μmol/L西達本胺組、10 μmol/L姜黃素組、聯合組的細胞增殖均有不同程度降低。重復測量方差分析顯示，各處理組細胞增殖的A值隨時間變化的趨勢（F=564.966，P＜0.001），且不同處理對細胞的增殖抑制差異有統計學意義（F=266.558，P＜0.001）。LSD-t檢驗顯示，24h時，聯合組細胞增殖的A值與1.2μmol/L西達本胺組相比，差異無統計學意義（P=0.499），但低于10 μmol/L姜黃素組，差異有統計學意義（P＜0.001）。48h時，聯合組細胞增殖A值低于1.2μmol/L西達本胺及10 μmol/L姜黃素，差異有統計學意義（均P＜0.001），而1.2 μmol/L西達本胺組顯著低于10 μmol/L姜黃素組（P＜0.001）。72 h時，聯合組細胞增殖的A值仍低于1.2 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組，差異有統計學意義（均P＜0.001），且1.2 μmol/L西達本胺組細胞仍顯著低于10 μmol/L姜黃素組（P＜0.001）。

表2 西達本胺和姜黃素作用Hut78細胞24 h后對細胞周期的影響（%，±s）

表2 西達本胺和姜黃素作用Hut78細胞24 h后對細胞周期的影響（%，±s）

注：n=3。聯合組為1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素

組別 G0/G1期 S期 G2/M期0.6 μmol/L西達本胺 53.96±5.06 34.13±4.04 12.59±2.53 1.2 μmol/L西達本胺 63.36±5.95 25.38±2.86 10.83±2.47 10 μmol/L姜黃素 55.90±3.11 32.64±3.33 11.30±1.25聯合組 69.72±5.57 22.90±1.62 6.22±2.16對照組 40.80±5.18 40.84±4.11 18.28±1.92 F值 22.476 18.219 19.492 P值＜0.01＜0.01＜0.01

二、西達本胺和姜黃素對Hut78細胞凋亡影響

0.6、1.2 μmol/L 西達本胺組、10 μmol/L 姜黃素組、聯合組、對照組凋亡細胞比例分別為差異有統計學意義（F=186.324，P=0.00）。兩兩比較顯示，0.6、1.2 μmol/L 西達本胺組、10 μmol/L 姜黃素組、聯合組的凋亡細胞比例均顯著高于對照組（均P＜0.01）；而 0.6 μmol/L 西達本胺組與 1.2 μmol/L 西達本胺組、10 μmol/L姜黃素組相比，差異無統計學意義（均P＞0.05）；1.2 μmol/L西達本胺組凋亡細胞比例明顯高于 10 μmol/L姜黃素組（P＜0.01）；聯合組的凋亡細胞比例均高于0.6、1.2 μmol/L西達本胺組、10 μmol/L姜黃素組，差異有統計學意義（均P＜0.001）。見圖 2。

圖2 流式細胞儀檢測西達本胺和姜黃素單用或聯合對Hut78細胞凋亡的影響 各組Hut78細胞處理24 h后，西達本胺及姜黃素均能誘導細胞凋亡，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素組對細胞的凋亡誘導作用最強

三、西達本胺和姜黃素對Hut78細胞周期影響

0.6、1.2 μmol/L 西達本胺，10 μmol/L 姜黃素，聯合組及對照組分別作用Hut78細胞24 h后，G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例差異均有統計學意義（表2）。與對照組相比，各實驗組G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例及G2/M期細胞比例明顯降低（均P＜0.05）。聯合組和1.2 μmol/L西達本胺組G0/G1期細胞比例明顯高于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組，而其S期細胞比例及G2/M期細胞比例明顯低于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.05）。而聯合組與1.2 μmol/L 西達本胺組，0.6 μmol/L 西達本胺組與10 μmol/L姜黃素組各細胞周期比例差異無統計學意義（均P＞0.05）。

四、西達本胺和姜黃素對Hut78細胞凋亡和細胞周期相關基因表達的影響

0.6、1.2 μmol/L 西達本胺，10 μmol/L 姜黃素，聯合組及對照組分別作用Hut78細胞24 h后，凋亡相關基因 Fas、caspase 8、NF-κB p65，細胞周期相關基因P21、CDK2、CyclinE mRNA的相對表達量差異有統計學意義（F值分別為265.439、121.476、67.340、487.653、59.129、34.385，均P＜0.01）。與對照組相比，各實驗組 Fas、caspase 8、P21 mRNA 的表達均明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA 的表達明顯降低（均P＜0.05）。聯合組和1.2 μmol/L西達本胺組Fas、caspase 8、P21 mRNA的表達明顯高于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001），而其 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA的表達均明顯低于0.6 μmol/L西達本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。聯合組 Fas mRNA的表達明顯高于1.2 μmol/L西達本胺組（P＜0.001）， 而 caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA的表達與1.2 μmol/L西達本胺組差異無統計學意義（均P＞0.05）。0.6 μmol/L西達本胺組與10 μmol/L姜黃素組相比，細胞凋亡和細胞周期各相關基因mRNA的表達量差異無統計學意義（均P＞0.05）。見圖3。

圖3 西達本胺和姜黃素單用或聯合對Hut78細胞的凋亡和細胞周期相關基因表達的影響 1～5分別為對照組、0.6 μmol/L西達本胺組、1.2 μmol/L西達本胺組、10 μmol/L姜黃素組，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素組。與對照組及各單獨用藥組相比，聯合組顯著增強了Fas、caspase 8、P21 mRNA 的表達，抑制了 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA 的表達

五、西達本胺和姜黃素對Hut78細胞凋亡和細胞周期相關蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，0.6、1.2 μmol/L西達本胺，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素分別作用 Hut78細胞 24 h 后，Fas、caspase 8、P21 蛋白的表達明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE蛋白的表達明顯降低。

圖4 西達本胺和姜黃素對Hut78細胞凋亡和細胞周期相關蛋白的影響 1～4分別為對照組、0.6、1.2 μmol/L西達本胺組、1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素組。與對照組相比，各實驗組作用Hut78細胞24 h后，Fas、caspase 8、P21蛋白條帶灰度逐漸增加，NF-κB p65、CDK2、CyclinE 蛋白條帶灰度逐漸減弱，GAPDH 為內參對照。與對照組和各單獨用藥組相比，1.2 μmol/L西達本胺聯合10 μmol/L姜黃素顯著增強了Fas、caspase 8、P21蛋白表達，抑制了NF-κB p65、CDK2、CyclinE 的蛋白表達

討 論

近年來，表觀遺傳學調控藥物-HDAC-Ⅰ逐漸應用于MF的治療［6］。HDAC-Ⅰ可以通過上調染色質中組蛋白的乙酰化水平活化基因表達，誘導細胞周期停滯來促進腫瘤細胞的凋亡［1］。非選擇性HDAC-I伏立諾他（vorinostat）是針對HDAC表觀遺傳的小分子藥物，現已被美國FDA批準用于CTCL的治療。臨床試驗顯示，口服伏立諾他對2次系統治療失敗的CTCL患者總體有效率可達到29%和42%，患者的瘙癢和生活質量也顯著改善［7-8］。西達本胺是選擇性HDAC抑制劑，與伏立諾他相比，它可特異性地針對與腫瘤發生和發展高度相關的第Ⅰ大類 HDAC 亞型，主要抑制 HDAC2和HDAC3［3］，具有高抗癌活性和低毒性。有研究［9］顯示，西達本胺能通過誘導P21表達明顯抑制胰腺癌細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性，并且能協同增加吉他西濱對胰腺癌細胞凋亡的誘導和增殖抑制。Dong等［10］用西達本胺對進展期實體腫瘤Ⅰ期進行臨床研究，結果顯示31例實體腫瘤中的5例非霍奇金淋巴瘤有4例達到部分緩解，部分緩解率達90%。我們的研究顯示，西達本胺作用Hut78細胞后，可明顯抑制細胞增殖并呈時間和濃度依賴性，還可明顯誘導細胞凋亡及細胞周期抑制，呈明顯的濃度依賴性。

細胞表面的死亡受體Fas是細胞凋亡的主要受體，當死亡配體FasL表達增加并與Fas結合，或者細胞受到某種刺激其表面Fas表達增加并與FasL結合，都可以誘導細胞凋亡通路的激活，然后凋亡級聯反應通路中的caspase 8被剪切活化，從而激活下游的效應caspase引起DNA鏈斷裂等一系列的細胞凋亡反應［11］。NF-κB與細胞凋亡有密切關系。大量研究表明，NF-κB激活能夠阻斷細胞死亡通路，保護細胞免于TNF和其它凋亡刺激因子誘導的凋亡級聯反應［12］。本研究顯示，西達本胺在誘導細胞凋亡的同時可引起凋亡相關基因Fas、caspase 8表達的升高，及NF-κB p65表達的降低。P21是細胞周期中非常重要的負性調節子，通過抑制CDK1和CDK2的活性而抑制細胞周期的進展，進而導致細胞的生長抑制［13］。本研究顯示，西達本胺在導致細胞增殖抑制和細胞周期停滯的同時，引起細胞周期相關基因P21表達的升高和細胞周期正性調節基因CDK2和CyclinE表達的降低。因此，我們推測，西達本胺可能通過上調Hut78細胞表面的Fas表達觸發了細胞的FasL-Fas細胞凋亡信號通路，并同時通過上調負性細胞周期相關基因P21的表達進而抑制CDK2和CyclinE的活性表達，從而引起細胞周期和細胞增殖的抑制。

姜黃素是從植物姜黃的根莖中分離的天然黃色顏料，在很多腫瘤細胞系和動物模型中抑制細胞生長和誘導凋亡。人體臨床試驗［4］顯示，當姜黃素的劑量達到12 g/d時也不存在劑量限制性毒性，并揭示姜黃素可通過抑制NF-κB信號選擇性誘導CTCL細胞凋亡。在CTCL中，NF-κB的活性對細胞存活和對凋亡抵抗是必須的［14-15］。本研究顯示，與單用西達本胺相比，西達本胺聯合姜黃素對Hut78細胞的增殖抑制、凋亡誘導和周期抑制作用更加明顯，并對凋亡相關基因Fas、caspase 8表達的升高，NF-κB p65表達的降低和細胞周期相關基因P21表達的升高，CDK2和CyclinE表達的降低作用均明顯高于單用西達本胺，顯示西達本胺聯合姜黃素能明顯提高抑制CTCL細胞系Hut78的生長率。

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Effects of chidamide combined with curcumin on human cutaneous T-cell lymphoma cell line Hut78 and their molecular mechanisms

Gu Xiaoguang,Wu Fangni,Zhang Qian,Zhang Chunlei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of chidamidecombined with curcumin on the proliferation of cutaneous T-cell lymphoma（CTCL）cell line Hut78,as well as their promotive effect on its apoptosis,and to explore their therapeutic mechanisms in CTCL.MethodsSome Hut78 cells were treated with different concentrations of chidamide（0.3,0.6,1.2,2.4 μmol/L）and 10 μmol/L curcumin alone or the combination of 1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin for 24,48 and 72 hours separately.MTS assay was conducted to estimate cell viability at each time point.After selection of chidamide concentrations,some Hut78 cells were treated with chidamide （0.6 and 1.2 μmol/L）and curcumin（10 μmol/L）alone or in combination（1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin）for 24 hours,then,flow cytometry was performed to detect cell apoptosis and analyze cell cycle,real-time（RT）-PCR and Western-blot analysis were conducted to quantify the mRNA and protein expressions of apoptosis-associated genes Fas,caspase 8,nuclear factor（NF）-κB p65 as well as cell cycle-associated genes P21,CDK2 and cyclin E respectively.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance,one-way analysis of variance and the least significant difference （LSD）-ttest.ResultsChidamide could significantly inhibit the proliferation of Hut78 cells in a dosedependent and time-dependent manner（F=266.558,564.966,respectively,bothP＜0.001）.After 48-and 72-hour culture,the combination of 1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin showed significantly stronger inhibitory effect on cell proliferation compared with 1.2 μmol/L chidamide or 10 μmol/L curcumin alone （allP＜0.001）.As flow cytometry showed,the percentage of apoptotic cells was significantly higher in the combined treatment group than in the 0.6-,1.2-μmol/L chidamide groups and 10-μmol/L curcumin group （allP＜0.001）.Compared with the 0.6-μmol/L chidamide group and 10-μmol/L curcumin group,the combined treatment group and 1.2-μmol/L chidamide group both showed significantly increased proportion of cells at G0/G1 phase and mRNA expressions of Fas,caspase 8 and P21,but decreased proportion of cells at S phase or G2/M phase and mRNA expressions of NF-κB p65,CDK2 and cyclin E （P＜0.05 for proportion of cells at different phases,P＜0.001 for mRNA expressions of different genes）.Furthermore,the mRNA expression of Fas was significantly higher in the combined treatment group than in the 1.2-μmol/L chidamide group （P＜0.001）,while no significant differences were observed in the mRNA expressions of caspase 8,P21,NF-κB p65,CDK2 and cyclin E or the proportion of cells at any phase between the combined treatment group and 1.2-μmol/L chidamide group （allP＞ 0.05）.Western-blot analysis showed that protein expressions of Fas,caspase 8 and P21 significantly increased,but those of NF-κB p65,CDK2 and cyclin E significantly decreased in the combined treatment group compared with the 0.6-,1.2-μmol/L chidamide groups and blank control group receiving no treatment,which were in accordance with the above changes in mRNA expressions of these genes.ConclusionChidamide can inhibit the growth of the CTCL cell line Hut78 by directly decelerating cell proliferation and inducing cell apoptosis,and the combibation with curcumin can markedly enhance the inhibitory effect of chidamide on the growth of Hut78 cells.

Lymphoma,T-cell,cutaneous;Curcumin;Cell proliferation;Apoptosis;Chidamide;Hut-78 cell

Zhang Chunlei,Email：zhangchunleius@163.com

2015-04-09）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

張春雷，Email：zhangchunleius@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.008

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