SASH1基因新雜合錯義突變與遺傳性泛發性色素異常癥一家系相關

姚磊 曾磊 付旭輝 湯華陽 李蔚然 陳剛 孫良丹 高敏 王培光 楊森 張學軍

230022合肥，安徽醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科 安徽醫科大學皮膚病研究所（姚磊、曾磊、湯華陽、李蔚然、陳剛、孫良丹、高敏、王培光、楊森、張學軍）；河南省開封市第二人民醫院皮膚科（付旭輝）

·論著·

SASH1基因新雜合錯義突變與遺傳性泛發性色素異常癥一家系相關

姚磊 曾磊 付旭輝 湯華陽 李蔚然 陳剛 孫良丹 高敏 王培光 楊森 張學軍

230022合肥，安徽醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科 安徽醫科大學皮膚病研究所（姚磊、曾磊、湯華陽、李蔚然、陳剛、孫良丹、高敏、王培光、楊森、張學軍）；河南省開封市第二人民醫院皮膚科（付旭輝）

目的 探討一家系遺傳性泛發性色素異常癥的臨床特征和分子遺傳學發病基礎。方法 對該家系進行詳細的遺傳學調查、體檢，并對先證者進行反射式共聚焦顯微鏡檢查和組織病理學檢查。采集8例家系成員（其中患者5例，正常個體3例）和200例家系外無親緣關系的健康對照的血樣，提取基因組DNA，PCR擴增SASH1和ABCB6基因的全部外顯子及其側翼序列，并進行DNA直接測序。結果 該家系符合常染色體顯性遺傳模式。家系中9例患者均在出生后1年內發病，皮損最初累及面部，后逐漸泛發于全身。健在的8例患者中，7例皮損表現為不規則淡褐色至深褐色色素沉著斑，其余皮膚呈均勻的色素減退。僅先證者大姐皮損表現為泛發性網狀色素沉著斑和色素減退斑。患者的口腔黏膜、指（趾）甲、牙齒和一般健康狀況均正常。DNA測序顯示，5例患者SASH1基因第15號外顯子上均出現1個雜合錯義突變（c.1761C＞G，p.Ser587Arg），而家系中3例正常個體及家系外200例健康對照均未檢測到此突變。此外，均未發現ABCB6基因突變。結論 遺傳性泛發性色素異常癥的臨床特征和分子遺傳學發病基礎存在異質性。SASH1基因的p.S587R突變可能是該家系患者發病的原因。

常染色體顯性；雜合子；突變；遺傳學；漢族；基因，SASH1；遺傳性泛發性色素異常癥

遺傳性泛發性色素異常癥（dyschromatosis universalis hereditaria，DUH）是一種臨床上少見的遺傳性色素異常性皮膚病，其臨床特征是皮膚和（或）黏膜泛發形狀及大小各異、顏色深淺不一呈網狀排列的色素沉著斑和色素減退斑。本病于1933年由日本學者Ichikawa和Hiraga首次描述，迄今已經報道至少50例，來自十多個國家，其中大多為家系，少數為散發病例。根據連鎖定位區域的不同，OMIM收錄3種DUH類型，分別為DUH1（OMIM 127500，6q24.2-q25.2）、DUH2（OMIM 612715，12q21-q23）和DUH3（OMIM 615402，2q35），其中，DUH1 和DUH3呈常染色體顯性遺傳，而DUH2為常染色體隱性遺傳［1-3］。目前研究發現，ABCB6 基因和SASH1 基因突變與DUH發病相關［3-4］。我們對一DUH家系開展臨床特征和分子遺傳學研究。

對象與方法

一、對象

DUH家系來自河南省，共4代15人，其中患者9例，包括男性患者4例和女性患者5例。在征得知情同意后，對DUH家系進行遺傳學調查和體檢，并對先證者進行皮膚反射式共聚焦顯微鏡檢查和皮膚組織病理學檢查。采集家系中5例患者和3例正常個體的血樣5 ml用于分子遺傳學研究，并采集200例無親緣關系的健康人外周靜脈血5 ml作為對照。

二、方法

1.皮膚反射式共聚焦顯微鏡檢查：選擇先證者前臂的色素沉著斑和腹部色素減退斑兩處典型皮損，應用波長830 nm的Vivascope 1500皮膚反射式共聚焦顯微鏡觀察皮損表皮和真皮淺層中色素變化情況。

2.皮膚組織病理學檢查：切取先證者前臂色素沉著斑和腹部色素減退斑兩處皮損，行HE染色和Melan-A染色。

3.DNA提取：采用德國Qiagen公司的Flexi基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

4.PCR引物設計：從基因庫數據（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank）分別獲取ABCB6和SASH1基因的參考序列，用Primer Premier 5.0軟件設計基因編碼區及其兩側50個堿基以上與內含子交界區域的引物；再利用UCSC網站的PCR頁面（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）進行引物特異性的檢驗，最后送美國Invitrogen公司進行引物合成。其中，SASH1基因第15號外顯子引物：上游5′-AGGTCACTCAGAGGGGTGA-3′，下游 5′-CTTACGC TATCACCCACAGC-3′。

5.PCR擴增及DNA測序：PCR反應體系15 μl，包含基因組DNA 50 ng，上下游引物各5 pmol，dNTPs 0.3 μl，Taq DNA 聚合酶 0.3 μl，25 mmol/L MgCl20.9 μl，緩沖液 1.5 μl，Qmix 3.0 μl。降落式PCR反應程序：94℃預變性5 min后，進行以下12個循環：94℃變性30 s，65℃退火40 s（退火溫度每個循環降低0.5℃），72℃延伸30 s；接著進行后25個循環：94℃變性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，共37個循環，最后72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物條帶是否均一明亮。純化后的PCR產物以Sanger雙脫氧鏈終止法為原理應用ABI 3730XL測序儀進行測序。

6.SASH1蛋白功能預測：對人、黑猩猩、長臂猿、小鼠、大鼠、家兔、牛、斑馬魚、鴨嘴獸和矛尾魚10種物種的SASH1蛋白序列進行比對。應用SIFT和Polyphen-2軟件預測p.Ser587Arg突變點是否為有害突變。

結 果

一、DUH家系的臨床特征

家系圖顯示該DUH家系共4代15人，每代均有發病，男性患者和女性患者例數相近。患者的雙親之一亦是患者，符合常染色體顯性遺傳模式（圖1）。家系中9例患者均在出生后1年內發病，皮損初發于面部，后逐漸泛發全身。此后皮損不隨年齡增長而變化。體檢：先證者全身泛發不規則淡褐色至深褐色色素沉著斑，直徑約2～5 mm，其中部分呈星芒狀。色素沉著之外的皮膚呈均勻的色素減退（圖2）。僅先證者大姐表現為泛發性網狀色素沉著斑和色素減退斑（圖3）。健在的8例患者的掌跖、黏膜、指（趾）甲及牙齒均未受累，體格及智力各方面均發育正常。先證者反射式共聚焦顯微鏡檢查顯示：色素沉著斑處基底層色素含量增多，呈高折光性，有多個明亮完整的色素環（圖4A）；色素減退斑處基底層色素缺失，折光減弱或無折光性，色素環缺如或部分可見殘存色素環（圖4B）。先證者皮損組織病理學檢查：色素沉著斑處表皮基底層黑素增多（圖4C），色素減退斑處表皮基底層色素顯著減少，黑素細胞數量正常（圖4D）。先證者色素沉著皮損處Melan-A染色示表皮內的黑素細胞數量和分布正常（圖4E）。

圖1 家系圖 圖中黑色箭頭代表此家系的先證者，a：代表采血并測序的樣本

圖2 先證者面部（2A）、背部（2B）和四肢（2C）泛發性淡褐色至深褐色色素沉著斑，邊緣不規則，其余皮膚為廣泛的色素減退

圖3 先證者大姐的臨床特征 面部（3A）、背部（3B）網狀的色素沉著斑和色素減退斑

圖4 先證者皮損 反射式共聚集顯微鏡和組織病理學特征 4A：色素沉著皮損：基底層色素增多，折光強，色素環明亮完整；4B：色素減退皮損：基底層色素缺失，色素環缺如或部分可見殘存色素環（50 μm）；4C：色素沉著皮損組織病理：表皮基底層黑素增多（×400）；4D：色素減退皮損：基底層色素減少（HE × 200）；4E：色素沉著皮損：黑素細胞在表皮基底層數量正常（Melan-A染色 ×400）

二、DNA直接測序

對ABCB6和SASH1兩個基因全部外顯子和側翼序列進行PCR擴增測序后發現，5例患者SASH1基因第15號外顯子上第1761位堿基胞嘧啶（C）雜合突變為堿基鳥嘌呤（G）（c.1761C＞G），導致相對應的中性氨基酸絲氨酸（S）變為帶正電荷的堿性氨基酸精氨酸（R）（p.Ser587Arg）（圖 5A）；家系中的 3 例正常個體及家系外200例無親緣關系的健康對照均未檢測到此突變（圖5B）。家系中5例患者及3例正常個體均未檢測到ABCB6基因突變。

三、SASH1蛋白功能預測

物種間序列比對分析發現，SASH1蛋白第587位絲氨酸序列為進化高度保守的序列。SIFT軟件對p.Ser587Arg功能預測結果為Affect Protein Function（score=0.03），Polyphen-2的預測結果為 Probably Damaging（score=0.998）。SIFT和Polyphen-2預測軟件分析該點突變為有害變異位點。

討 論

常染色體顯性DUH通常在出生時或出生后的1年內開始發病，皮膚出現泛發性色素沉著斑和色素減退斑，網狀排列，呈現斑駁狀外觀。色素斑直徑2～5 mm，邊緣不整齊，呈星芒狀，色素沉著為淡褐色至深褐色不等，多累及軀干和四肢，50%累及面部，掌跖、黏膜、指（趾）甲及牙齒受累者較罕見。部分DUH患者還可伴身材矮小、智力障礙、高頻耳聾、癲癇、結節性硬化癥［5］、“刀砍樣”硬皮病［6］等缺陷。在本例家系中，健在的8例患者中7例皮損表現為泛發性淡褐色至深褐色斑疹，其余皮膚為均勻的色素減退，未有呈現網狀排列的外觀，臨床上容易誤診為家族性進行性色素沉著癥或泛發性雀斑樣痣。皮損組織病理學顯示，表皮基底層黑色素增多或減少，而黑素細胞數量、結構正常。

圖5 患者及對照SASH1基因測序結果 5A：家系患者出現SASH1基因的雜合錯義突變（箭頭）c.1761C＞G（p.S587R）；5B：家系正常個體和健康對照該位點測序圖

Kim等［7］認為，黑素細胞的合成速率異常和（或）黑素小體分布缺陷是導致DUH的原因。2003年，Xing等［1］將2例常染色體顯性漢族DUH家系（Xing等診斷為 DSH。Miyamura 等［8］認為應是 DUH）致病基因定位于6q24.2-q25.2上約10.2 Mb的區域。2013年，Zhou等［4］對3例無親緣關系的漢族人DUH家系中的先證者在該定位區域內進行候選基因測序，發現SASH1基因編碼區的3種雜合錯義突變，分別為 c.2126T＞G（p.Tyr551Asp）、c.2019T＞ C（p.Leu515Pro）及 c.2000G ＞ A（p.Glu509Lys）。同年，Zhang等［3］對1例5代漢族人常染色體顯性DUH大家系進行全基因組連鎖定位和外顯子測序，結果發現位于2q33.3-q36.1區域的ABCB6基因發生1個雜合錯義突變c.1067T＞C（p.Leu356Pro）。此外在6例散發病例中的2例檢測到ABCB6基因的另外2種雜合錯義突變，即 c.508A＞G（p.Ser170Gly）和c.1736G＞A（p.Gly579Glu）。此后，國內多個研究小組在DUH家系或散發病例中檢測到ABCB6基因突變［9-11］。本研究結果證實，Zhou 等［4］的研究發現，c.1761C ＞G（p.Ser587Arg）為 SASH1基因一個新的突變位點。

SASH1基因定位于染色體6q24.3區域，全長7 709bp，包含20個外顯子，其編碼蛋白是由1247個氨基酸組成的SLY家族的信號銜接蛋白，相對分子質量為137 000，包含1個SH3功能域和2個SAM功能域。1個SH3結構域由第557～613位氨基酸組成，2個SAM結構域分別由第633～698位氨基酸和第1 173～1 242位氨基酸組成。SH3結構域能識別脯氨酸富集基序，參與蛋白間相互作用。2003年，Zeller等［12］研究乳腺癌發現，SASH1 基因為一種潛在的腫瘤抑制基因，此后陸續發現SASH1表達降低與多種惡性腫瘤的細胞生長、增殖和遠處轉移密切相關。此外，SASH1還參與多種信號轉導通路的調節［13-15］。突變的 SASH1蛋白通過增加與Gαs和IQGAP1的結合導致E鈣粘素表達減少，引起DUH發病過程中黑素細胞特定的遷移和分布［4］。ABCB6位于染色體2q36區域，全長3021bp，包含19個外顯子，其編碼蛋白為842個氨基酸組成的ATP結合盒半轉運蛋白，包含2個保守的ABC轉運體跨膜功能域和1個保守的ATP結合盒功能域。Jalil等［16］指出ABCB6蛋白以糖基化蛋白的形式錨定于胞內囊泡膜上，參與細胞內外的物質轉運，維持金屬離子的體內平衡，尤其是金屬銅離子。銅離子是酪氨酸酶的協同因子，在啟動黑素小體合成黑素中發揮重要的作用。

本文5例患者均出現與臨床表型共分離的SASH1基因上的1個新的雜合錯義突變c.1761C＞G（p.Ser587Arg）。野生型第587位絲氨酸殘基位于高度保守的SH3功能域上，是肽配體結合區之一。該點突變經過SIFT和Polyphen-2軟件預測均為有害性變異位點，提示S587R突變可能影響SASH1蛋白的正常功能。先證者皮損Melan-A染色顯示黑素細胞在表皮中的數量和分布均正常，因此，該家系DUH的色素異常可能與黑素細胞中的黑素向周圍角質形成細胞的轉運障礙有關。

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A novel heterozygous missense mutation in the SASH1 gene is associated with dyschromatosis universalis hereditaria in a pedigree

Yao Lei,Zeng Lei,Fu Xuhui,Tang Huayang,Li Weiran,Chen Gang,Sun Liangdan,Gao Min,Wang Peiguang,Yang Sen,Zhang Xuejun
Institute of Dermatology and Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022,China（Yao L,Zeng L,Tang HY,Li WR,Chen G,Sun LD,Gao M,Wang PG,Yang S,Zhang XJ）;Department of Dermatology,Second People′s Hospital of Kaifeng City,Kaifeng 475000,Henan,China（Fu XH）

ObjectiveTo investigate clinical features and molecular genetic basis of dyschromatosis universalis hereditaria（DUH）in a pedigree.MethodsA detailed genetic survey and a physical examination were performed for available members in a pedigree with DUH.In addition,reflectance confocal microscopy and histopathology were carried out to observe skin lesions of the proband.Blood samples were collected from 8 family members（including 5 patients with DUH and 3 unaffected members）and 200 unrelated healthy human controls.The FlexiGene DNA kit was used to extract genomic DNA from these blood samples,and PCR was performed to amplify all coding exons and their flanking sequences of SASH1 and ABCB6 genes followed by direct DNA sequencing.ResultsDUH was inherited in an autosomal dominant manner in this pedigree,and occurred within 1 year after birth in 9 patients.Lesions initially appeared on the face,then gradually spread to the whole body.Among 8 surviving patients,7 presented with irregularly shaped light brown to puce macules complicated by uniform hypopigmentation of the remaining skin,and only the elder sister of the proband showed generalized hyperpigmented macules mingled with hypopigmented macules in a reticular pattern.No abnormality was observed in oral mucosa,nails or teeth,and general status was good in the 8 patients.DNA sequencing revealed a novel heterozygous missense mutation（c.1761C＞G,p.Ser587Arg）in exon 15 of the SASH1 gene in the 5 available patients,but not in the 3 unaffected individuals or 200 healthy controls.No mutation was found in the ABCB6 gene in any of the 8 family members.ConclusionsHeterogeneity exists in clinical features and molecular genetic basis of DUH.The heterozygous missense mutation p.S587R in the SASH1 gene might be responsible for DUH in this family.

Autosomal-dominant;Heterozygote;Mutation;Genetics;Han nationality;Genes,SASH1;Dyschromatosis universalis hereditaria

Wang Peiguang,Email：wpg2370@163.com

2015-07-20）

（本文編輯：吳曉初）

王培光，Email：wpg2370@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.001