角質形成細胞無血清培養基條件下構建組織工程皮膚

林建紅 汪宇 盧彬 劉志 江蕾微 王今朝 張偉 李世軍 陸洪光

550004貴陽，貴州醫科大學附屬醫院皮膚科（第一作者現在湖南省邵陽市第一人民醫院皮膚科，422000）

角質形成細胞無血清培養基條件下構建組織工程皮膚

林建紅 汪宇 盧彬 劉志 江蕾微 王今朝 張偉 李世軍 陸洪光

550004貴陽，貴州醫科大學附屬醫院皮膚科（第一作者現在湖南省邵陽市第一人民醫院皮膚科，422000）

目的 探討在角質形成細胞無血清培養基條件下，用人成纖維細胞、角質形成細胞和黑素細胞接種于人去表皮真皮構建組織工程皮膚。方法 胰酶和膠原酶消化處理健康小兒包皮，獲得表皮和真皮細胞懸液。分別將角質形成細胞、黑素細胞傳至第3代，成纖維細胞傳至第5代，調整細胞密度為2.5×105/ml。制備人去表皮真皮（含部分基底膜成分），先將成纖維細胞懸液種于6孔板板底，24 h后將人去表皮真皮放入6孔板，角質形成細胞、黑素細胞懸液接種于人去表皮真皮表面（成纖維細胞、角質形成細胞、黑素細胞比例為1∶4∶1。實驗組用角質形成細胞無血清培養基培養,對照組用含10%FBS的DMEM、K-SFM、M254，3種培養液比例為1∶1∶1的混合培養基培養，人去表皮真皮作為空白對照。液下培養3 d后，空氣液面培養相結合的方式進行培養，每 3 天換液 1 次，2 周后取培養的組織工程皮膚分別行 HE 染色，Melan-A、S-100、HMB45、CKpan、P63、K5、K6、K14、Ki67、Vimentin、CollagenⅣ、Laminin免疫組化染色及PAS染色并取正常皮膚做陽性對照。結果 經過14 d的氣液培養，實驗組出現完整的新生表皮結構,CKpan、P63、K5、K6、K14、Ki67、Melan-A、S-100、HMB45、CollagenⅣ、Laminin免疫組化染色陽性；對照組出現完整的新生表皮結構,可見角質層,CKpan、P63、K5/6、K14、Ki67、Laminin免疫組化染色陽性。結論 角質形成細胞、黑素細胞及成纖維細胞與人去表皮真皮在角質形成細胞無血清培養基條件下，體外可構建組織工程皮膚。

皮膚；組織工程；培養基，無血清；成纖維細胞；黑素細胞；角蛋白細胞

體外構建組織工程皮膚因其能較好地模擬皮膚的生理功能甚至用于疾病的治療而引起廣泛關注，相繼很多學者對此進行研究和改進［1-2］。大多皮膚模型構建均有血清成分的參與，始終存在潛在的風險。本實驗在角質形成細胞無血清培養基（K-SFM）條件下用角質形成細胞（KC）、黑素細胞（MC）及成纖維細胞（Fb）共同體外構建組織工程皮膚。并通過對新生表皮進行表皮相關分化蛋白標記物進行免疫組化，對新生表皮的分化、增殖功能進行分析。

資料與方法

一、資料

1.主要試劑：K-SFM、EGF、BPE、M254、HMGS和高糖型DMEM培養基購自美國Gibico生物公司。Ⅳ型膠原酶購自北京索萊寶科技有限公司公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，谷氨酰胺和0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA購自美國Sigma公司。兔抗人CKpan多克隆抗體、兔抗人S100多克隆抗體、鼠抗人HMB45單克隆抗體、鼠抗人Melan-A單克隆抗體、鼠抗人P63單克隆抗體、鼠抗人Ki67單克隆抗體、即用型CK14鼠抗人單克隆抗體、即用型CK14鼠抗人單克隆抗體、4%甲醛固定液、檸檬酸磷酸鹽修復液、即用型兔抗人蛋白基因產物9.5免疫組化多克隆抗體、即用型MaxVisionTM試劑及DAB顯色液均由福州邁新生物技術有限公司生產。

2.主要儀器：CO2細胞培養箱3100型購自美國Thermo公司，CK40-F200型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司。自制組織培養支撐架［3］常規消毒滅菌處理后備用。

3.標本采集：貴州醫科大學院附屬醫院小兒外科6～12歲患兒包皮環切術后的正常包皮組織。實驗經本院倫理委員會批準，患者家屬均簽署知情同意書。

二、方法

1.KC、MC及Fb的分離培養：將包皮用無菌生理氯化鈉溶液和聚維酮碘各沖洗2次，然后用含有雙抗（含100U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）的PBS液沖洗包皮5次，將包皮剪成0.5 cm×1 cm的細長條，Dispase酶4℃消化16～18 h。18 h后將表皮與真皮分離，表皮用0.25%胰酶0.01%EDTA室溫消化2～3 min，用10%FBS的DMEM終止消化，低速離心（224×g），用M-254重懸，計數板計數，調整細胞密度為2×106/ml，分別接種于一次性培養瓶中。真皮組織用0.2%Ⅳ型膠原酶37℃消化2～3 h，用含10%FBS的DMEM重懸，調整細胞密度為2×106/ml，接種于一次性培養瓶中。置于孵箱（5%CO2、37℃）中培養，24h后首次換液，每3天換液1次。15～20d后傳代，取第3代KC、MC及第5代Fb進行實驗。

2.細胞貼附情況觀察：分別將KC、MC及Fb制成1×105/ml的細胞懸液，每3天換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察細胞貼附情況。

3.細胞爬片及抗 CKpan、L-Dopa及 Vimentin染色均由福州邁新生物技術開發有限公司完成。

4.去表皮真皮制備：標本來源于貴州醫科大學附屬醫院急診骨外科32歲男性截肢大腿處壞死組織周圍正常皮膚。將皮下脂肪組織層剪除，制成1cm×1 cm皮片，在56℃PBS恒溫水浴箱中浸泡30 min，用眼科鑷分離真表皮，將真皮置于1.5 ml微量離心管中，迅速置入液氮中6～8 min，取出后室溫放置30 min，如此重復10個循環，-20℃冰箱中保存備用［4］，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

5.KC、MC及Fb與去表皮真皮體外構建組織工程皮膚：取第5代密度為2.5×105/ml的Fb各8 μl分別接種于含相應培養基3 ml的兩個6孔板中，其中一個用含等比例的10%DMEM、完全M-254、完全K-SFM培養，另外一個單獨用完全K-SFM。將6孔板置于溫箱（5%CO2、37℃）環境中孵育備用。24 h后，將經預處理的去表皮真皮，基底膜面向上置于板底含成纖維細胞的6孔板中，用移液器將第3代密度為 2.5×105/ml MC、KC細胞懸液各 8 μl、32 μl接種于去表皮真皮上，將6孔板置于溫箱（5%CO2、37℃）環境中孵育，以促使 MC、KC緊密地貼附于去表皮真皮。4 h后，實驗組加入單一無血清的完全K-SFM培養基，對照組加入等比例的10%FBS的DMEM培養基、完全M-254培養基以及無血清的完全K-SFM培養基共3 ml，使之浸沒去表皮真皮，置于溫箱（5%CO2、37℃）中培養，每 2、3天換液1次。上述兩組分別用不添加任何細胞的去表皮真皮作為陰性對照。

6.組織工程皮膚HE染色及Melan-A、S-100、HMB45、CKpan、P63、CK14、CK5/6、Ki67、Vimentin、CollagenⅣ、Laminin免疫組化染色，正常人乳房皮膚作為陽性對照，HE及免疫組化染色均由福州邁新生物技術開發有限公司完成。

結 果

1.細胞貼附情況：第3代MC培養7 d后，輪廓清楚、折光性好，形態多樣，主要呈樹突狀，見圖1。第3代KC培養5 d后呈典型上皮細胞鋪路石樣，見圖2。第5代FBs培養5 d后，生長排列多呈放射狀、編織狀或漩渦狀走行，見圖3。

2.KC、MC及Fb爬片免疫組化檢測：KC行CKpan免疫組化染色示胞質呈棕黃色陽性著色，見圖4A。MC行L-Dopa染色，L-Dopa染色示細胞呈黑色，見圖4B。Fb行vimentin免疫組化染色示胞質呈棕黃色陽性著色，見圖4C。

3.培養2周后HE染色：實驗組組織工程皮膚表皮結構清晰，排列整齊，未見顆粒層、透明層，部分細胞胞質空泡化，見圖5A，5B。對照組組織工程皮膚表皮結構清晰，層次分明，角質層角化不完全，見圖5D，5E。各組空白對照去表皮真皮無細胞生長，見圖5C，5F。正常皮膚表皮結構清晰，層次分明，見圖 5G，5H。

4.Melan-A、S-100、HMB45、CKpan、P63、CK14、CK5/6、Ki67、Vimentin、CollagenⅣ、Laminin 染色：組織工程皮膚及正常皮膚可見表皮細胞胞質CKpan免疫組化染色表皮細胞均呈陽性反應，胞質呈棕黃色，見圖6A～6C。組織工程皮膚及正常皮膚P63免疫組化，可見表皮基底層、棘層部分細胞呈陽性反應，細胞核呈棕黃色，見圖7A～7C。CK14免疫組化，可見實驗組、正常組基底層、棘層細胞胞質呈棕紅色，對照組表皮全層細胞胞質陽性。CK5/6免疫組化顯示實驗組、正常皮膚表皮胞質呈棕黃色陽性反應。組織工程皮膚及正常皮膚Ki67免疫組化，可見表皮基底層、棘層部分細胞呈陽性反應，細胞核呈棕紅色，見圖8A～8C。Mel-A、S-100、HMB-45染色，實驗組可見表皮基底層部分細胞呈陽性反應，細胞質呈棕黃色。對照組陰性。正常皮膚Mel-A、S-100、HMB-45陽性對照，可見表皮基底層部分細胞呈陽性反應，細胞質呈棕黃色。

圖1 培養7 d，第3代黑素細胞輪廓清楚、折光性好，形態多樣，主要呈樹突狀（倒置顯微鏡×100）

圖2 培養5 d，第3代角質形成細胞呈典型上皮細胞鋪路石樣（倒置顯微鏡×400）

圖3 培養5 d，第5代成纖維細胞呈放射狀、編織狀或漩渦狀走行（倒置顯微鏡×100）

圖4 4A：第3代角質形成細胞胞質呈棕黃色陽性著色（CKpan免疫組化×200）；4B：第3代黑素細胞呈樹突狀，細胞呈黑色（L-Dopa染色×400）；4C：第5代成纖維細胞胞質呈棕黃色陽性著色（Vimentin免疫組化×200）

討 論

盡管有研究將培養的KC組織工程皮膚用于疾病的治療［5-6］，實際上在體外進行擴增或構建人工皮膚時，添加了血清的成分促進其分化與增殖，而血清中所含生長因子和生長激素的含量變化大，且成分極為復雜，不利于組織工程皮膚生長及安全性的調控［7］。本實驗使用的K-SFM，成分包含表皮生長因子和牛腦垂體提取物，有促進角質形成細胞的增值、分化［8］和遷移［9］。其中不含血清成分，并且已證明可用于角質形成細胞的體外擴增培養［10-11］。利用無血清培養基體外構建組織工程皮膚除了獲得臨床治療上的優勢外，還可為進一步研究KC、MC及Fb旁分泌之間的關系提供了研究基礎。除此之外，在體外構建組織工程皮膚，細胞支架及基質（即真皮替代物）在體外構建組織工程皮膚過程中對誘導細胞發育成完整的表皮結構起到重要的作用。我們選用的去表皮真皮支架是經過一系列處理后將去表皮的真皮組織細胞殺死，去表皮真皮表面及真皮內殘留的附屬器導管內存在豐富的粘多糖，保留部分基底膜及膠原蛋白成分，完整地保持了真皮膠原纖維和彈性纖維的結構［4］。可能為誘導表皮生長發育提供了微環境，不僅有利于種子細胞的黏附、發育和分化，而且其生物相容性好。

圖5 第14天，實驗組組織工程皮膚表皮結構清晰，排列整齊，未見顆粒層、透明層，部分細胞胞質空泡化（5A：HE×100；5B：HE×400）；5C：實驗組去表皮的真皮空白對照，無表皮生長（HE×200）。第14天對照組組織工程皮膚表皮結構清晰，層次分明，角質層角化不完全。（5D：HE×40；5E：HE×200）；5F：對照組去表皮的真皮空白對照，無表皮生長（HE×200）。正常皮膚組織表皮結構清晰，層次分明（5G：HE×40；5H：HE × 200）

圖6 實驗組組織工程皮膚（6A）、對照組組織工程皮膚（6B）、正常皮膚組織（6C）CKpan免疫組化染色，胞質呈棕黃色（免疫組化×200）

KC與Fb之間有完整的作用通路：一方面，KC分泌IL-1促進Fb分泌IL-6、IL-8、角質形成細胞生長因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等，這些因子可促進KC的分化與增殖。另一方面，KC分泌甲狀旁腺素相關肽，增加Fb分泌角質形成細胞生長因子，角質形成細胞生長因子反過來作用于KC促進其分化與增殖［12］。前期［10］研究提示，Fb 不能通過去表皮真皮表面往真皮層生長或者進入真皮層的細胞較少，所以，我們將Fb種于培養板底，通過細胞分泌的相關因子來相互影響重建皮膚組織表皮細胞的生長。

通過對K-SFM培養基培養的KC、MC及Fb體外構建的組織工程皮膚新生細胞相關標記蛋白進行免疫組化分析。結果表明，在K-SFM完全培養基培養下，KC、MC及Fb體外構建的新生表皮具有類似于正常皮膚的分化、增殖功能以及黑素細胞的存在使色素修復成為可能，這些均為臨床應用提供了基礎。

圖7 實驗組組織工程皮膚（7A）、對照組組織工程皮膚（7B）、正常皮膚組織（7C）表皮基底層、部分棘層細胞P63表達，細胞核呈棕黃色（免疫組化×200）

圖8 實驗組組織工程皮膚（8A）、對照組組織工程皮膚（8B）、正常皮膚組織（8C）表皮基底層、部分棘層細胞Ki67表達，細胞核呈棕紅色（免疫組化×400）

［1］Bullock AJ,Higham MC,MacNeil S.Use of human fibroblasts in the development of a xenobiotic-free culture and delivery system for human keratinocytes［J］.Tissue Eng,2006,12（2）：245-255.DOI：10.1089/ten.2006.12.245.

［2］Coolen NA,Verkerk M,Reijnen L,et al.Culture of keratinocytes for transplantation without the need of feeder layer cells［J］.Cell Transplant,2007,16（6）：649-661.DOI：http：//dx.doi.org/10.3727/000000007783465046.

［3］Halaban R,Ghosh S,Duray P,et al.Human melanocytes cultuerd from nevi and melanomas［J］.Invest Dermatol,1986（87）：95-101.DOI：10.1111/1523-1747.ep12523594.

［4］Onuma H,Mastui C,Morohashi M.Quantitative analysis of the proliferation of epidermal cells using a human skin organ culture system and the effect of DbcAMP using markers of proliferation（BrdU,Ki-67,PCNA）［J］.Arch Dermatol Res，2001,293（3）：133-138.DOI：10.1007/s004030000195.

［5］Nayak S,Dey S,Kundu SC.Skin equivalent tissue-engineered construct：co-cultured fibroblasts/keratinocytes on 3d matrices of sericin hope cocoons［J］.PloS One,2013,8 （9）：e74779.DOI：10.1371/journal.pone.0074779.eCollection 2013.

［6］Varkey M,Ding J,Tredget EE,et al.The effect of keratinocytes on the biomechanical characteristics and pore microstructure of tissue engineered skin using deep dermal fibroblasts［J］.Biomaterials,2014,35（36）：9591-9598.DOI：10.1016/j.biomaterials.2014.07.048.

［7］Noser FK,Limat A.Organotypic culture of outer root sheath cells from human hair follicles using a new culture device［J］.In Vitro Cell Dev Biol,1987,23（8）：541-545.DOI：10.1007/BF02620971.

［8］Shipley GD,Keeble WW,Hendrickson J E,et al.Growth of normal human keratinocytes and fibroblasts in serum-free medium is stimulated by acidic and basic fibroblast growth factor［J］.J Cell Physiol,1989,138（3）：511-518.DOI：10.1002/jcp.1041380310.

［9］Sogabe Y,Abe M,Yokoyama Y,et al.Basic fibroblast growth factor stimulates human keratinocyte motility by Rac activation［J］.Wound Repair Regen,2006,14 （4）：457-462.DOI：10.1111/j.1743-6109.2006.00143.x.

［10］陸洪光,郭哲,崔紹山,等.表皮體外重建模型的研究［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（12）：738-740.DOI：10.3760/j.issn：0412-4030.2005.12.007.Lu HG,Guo Z,Cui SS,et al.A study of reconstructed human epidermis modelin vitro［J］.Chin J Dermatol,2005,38（12）：738-740.DOI：10.3760/j.issn：0412-4030.2005.12.007.

［11］Boyce ST,Ham RG.Cultivation,frozen storage,and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media［J］.J Tissue CultMethods,1985,9 （2）：83-93.DOI：10.1007/BF01797779.

［12］Taniguchi K,Arima K,Masuoka M,et al.Periostin controls keratinocyte proliferation and differentiation by interacting with the paracrine IL-1α/IL-6 loop［J］.J Invest Dermatol，2014,134（5）：1295-1304.DOI：10.1038/jid.2013.500.

Reconstruction of tissue-engineered skin using keratinocyte serum-free medium

Lin Jianhong,Wang Yu,Lu Bin,Liu Zhi,Jiang Leiwei,Wang Jinzhao,Zhang Wei,Li Shijun,Lu Hongguang
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China（the current affiliation of the first author was Department of Dermatology,First People′s Hospital of Shaoyang,Shaoyang 422000,Hunan,China）

ObjectiveTo reconstruct tissue-engineered skin by co-culture of human fibroblasts,keratinocytes and melanocytes on human de-epidermized dermis with keratinocyte serum-free medium （K-SFM）.MethodsHealthy children′s prepuce tissues were treated with pancreatin and collagenase to prepare epidermal and dermal cell suspensions respectively.After keratinocytes and melanocytes were cultured separately up to passage 3 and fibroblasts up to passage 5,the density of these cells was adjusted to 2.5×105/mlfor the following experiment.Human de-epidermized dermis containing some components of the basement membrane was prepared.Firstly,fibroblast suspensions were seeded at the bottom of 6-well plates followed by 24-hour culture.Subsequently,the prepared de-epidermized dermis was added into the 6-well plates,then,keratinocyte and melanocyte suspensions were seeded on the surface of the de-epidermized dermis with the melanocyte∶keratinocyte∶fibroblast ratio being 1∶4∶1.After 4 hours of culture,the cell mixtures were divided into two groups：an experimental group cultured with K-SFM,a control group cultured with a mixed medium containing DMEM with 10%fetal bovine serum,K-SFM and M254 at a ratio of 1 ∶1∶1.De-epidermized dermis cultured with K-SFM or the mixed medium alone served as blank control groups.After submerged cultivation for 3 days,the tissue cultures were maintained at an air-liquid interface for another 11 days with the culture medium changed every 3 days.Finally,these cultures were subjected to hematoxylin and eosin staining,periodic acid-Schiff（PAS）staining and immunohistochemical staining for Melan-A,S-100,HMB45,cytokeratin-Pan,P63,K5,K6,K14,Ki67,vimentin,collagenⅣand laminin.ResultsAfter 14-day submerged and air-liquid interface culture,a well-structured epidermis developed in both the experimental group and control group with the formation of the stratum corneum.The immunohistochemical study showed positive staining for cytokeratin-Pan,P63,K5,K6,K14,Ki67,laminin in both the experimental group and control group,but positive staining for Melan-A,S-100,HMB45 and collagenⅣin only the experimental group.ConclusionTissue-engineered skin can be constructed using keratinocytes,melanocytes and fibroblasts co-cultured on de-epidermized dermis with K-SFMin vitro.

Skin;Tissue engineering;Culture media,serum-free;Fibroblasts;Melanocytes;Keratinocytes

Lu Hongguang,Email：hongguanglu@hotmail.com

2015-06-08）

（本文編輯：吳曉初）

陸洪光，Email：hongguanglu@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.006