T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3對黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細胞的影響

呂雅琳 周曉偉 胡彬 吳瓊 曾學思 劉毅 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（呂雅琳、胡彬、吳瓊、曾學思、劉毅、孫建方），江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（周曉偉）

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3對黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細胞的影響

呂雅琳 周曉偉 胡彬 吳瓊 曾學思 劉毅 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（呂雅琳、胡彬、吳瓊、曾學思、劉毅、孫建方），江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（周曉偉）

目的 探討體外T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）對與小鼠黑素瘤B16F10細胞共培養的酪氨酸相關蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴細胞的影響。方法 構建TIM-3重組質粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2，分別轉染重組質粒及空質粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T細胞，繼續培養48 h，制備含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠，分離小鼠脾淋巴細胞，用TRP-2180-188抗原肽和白細胞介素（IL）-2刺激培養5 d，以未刺激細胞作為對照組。構建B16F10細胞與上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細胞共培養體系，分為空白對照組（加293T細胞培養48 h上清液）、TIM-3組（加含TIM-3上清液）、陰性對照組（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法檢測細胞增殖情況，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測共培養體系中干擾素（IFN）-γ和腫瘤壞死因子（TNF）-α濃度，流式細胞儀檢測共培養體系中CD8+T淋巴細胞。結果 酶切和測序鑒定證實目的基因正確插入真核表達載體中，檢測到轉染重組質粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T細胞上清液中有TIM-3表達，轉染空質粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T細胞上清液中有Ig-tail的表達。CCK-8法檢測顯示24 h時空白對照組、陰性對照組、TIM-3組淋巴細胞增殖活力分別為（100.00±10.42）%、（108.70±9.90）%、（78.06±6.37）%，48 h 時分別為（100.00±6.24）%、（168.00±2.98）%、（42.93±5.93）%；24 h、48 h時TIM-3組淋巴細胞活力低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。TIM-3組48 h相比24 h淋巴細胞增殖倍數低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。24 h時，空白對照組、陰性對照組、TIM-3組 IFN-γ濃度分別為（216.44±7.85）、（223.67±7.79）、（192.96±5.05）ng/L，48 h時分別為（230.06±4.23）、（167.24±3.33）、（54.95±0.57）ng/L。24 h、48 h時，TIM-3組 IFN-γ 濃度低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。24 h、48 h時，TIM-3組TNF-α濃度低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。24 h時空白對照組、陰性對照組、TIM-3組CD8+T淋巴細胞中位數分別為0.421%、2.22%、3.30%，48 h時分別為0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h時TIM-3組CD8+T淋巴細胞中位數高于空白對照組和陰性對對照組。結論 TIM-3在體外能夠抑制B16F10細胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細胞共培養體系中淋巴細胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α，提高CD8+T淋巴細胞。

黑色素瘤，實驗性；疫苗，亞單位；T淋巴細胞，細胞毒性；干擾素γ；T細胞免疫球蛋白粘蛋白-3

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin and mucin domain，Tim）家族基因主要表達于T細胞，其編碼的蛋白包括信號肽、免疫球蛋白區、黏蛋白區、跨膜區和有磷酸化位點的胞內區［1］。TIM家族在鼠中包括8個成員，在人類中包括3個成員。TIM-3為該家族成員，是一種重要的負性調控分子，抑制Th1介導的自身免疫反應和同種免疫反應，促進免疫耐受，參與腫瘤的免疫逃逸。本研究探討體外TIM-3對黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細胞增殖、干擾素（IFN）γ和腫瘤壞死因子（TNF）α分泌及對CD8+T淋巴細胞的影響。

資料和方法

一、動物、細胞、試劑和儀器

6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠（揚州大學實驗動物中心，合格證201512801），DH5α感受態細胞（大連Takara公司）；人腎上皮細胞293T細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），小鼠黑素瘤細胞株B16F10（美國標準生物品收藏中心），pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質粒（美國InvivoGen公司），RPMI-1640培養基、Opti-MEM培養基、胎牛血清、胰蛋白胨、酵母浸出粉（美國Gibco公司），脂質體LipofectamineTM2000、胰蛋白酶、CpG-ODN1826、TRP-2180-188抗原肽（美國Invitrogen公司），DNA分子標志物（大連TAKARA公司），抗生素Zeocin（法國Cayla公司），山羊抗小鼠IgG2a單抗（美國Proteintech公司），弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、小鼠白細胞介素（IL）2（美國 Sigma公司），小鼠淋巴細胞分離液、鼠IFN-γ ELISA試劑盒、鼠TNF-α ELISA試劑盒（深圳達科為生物技術有限公司），絲裂霉素（江蘇泰諾源生物技術有限公司），CCK-8細胞計數試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠CD8a抗體（德國美天旎生物公司），紫外分光光度計（DU800，美國Beckham Coulter公司），PCR儀、凝膠成像及分析裝置（美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（FACSVerseTM，美國BD公司）。

二、TIM-3真核表達載體的構建及表達

1.TIM-3真核表達載體的構建及驗證：在線檢索TIM-3蛋白質氨基酸序列及開放讀碼框ORF，通過BLAST比對由ORF得到的氨基酸序列和核酸序列。通過TMpred預測TIM-3可能的跨膜區域，同時參照Uniprot蛋白數據庫檢索結果確定TIM-3胞外域。根據其胞外域結構及相應的ORF用Primer premier5設計引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

小鼠TIM-3蛋白包含281個氨基酸，預測其中1-19位為信號肽，20-193為胞外域，194-214位為跨膜區。設計擴增優化后的Tim3Ig融合蛋白（1-193位氨基酸）的核酸序列，正向引物：5′-GAATTC GCCGCCACCATG-3′，反向引物：5′-GGATCCTCAA TGATGATG-3′。

從小鼠淋巴結細胞RT-PCR獲得的原始序列構建到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質粒上的表達量很低，分析原始序列包含7個稀有密碼子，對其進行優化，但不影響小鼠TIM-3的體外表達，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，將優化后的表達序列連接到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質粒上，酶切驗證并測序比對。

2.TIM-3真核表達載體的表達：將狀態良好、處于對數生長期的293T細胞按1×105細胞/孔的濃度接種于24孔培養板中，加入500 μl含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培養基，于37℃、5%CO2環境中培養，細胞匯合至90%以上時開始轉染，將培養基更換為Opti-MEM無血清培養基，每孔400 μl；參照 LipofectamineTM2000 操作說明進行pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質粒及pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2質粒轉染，ELISA法檢測轉染后48 h上清液中TIM-3及Ig-tail的濃度，凍存上清液備用。

三、TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠及B16F10細胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細胞共培養體系的構建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：初次免疫每份肽疫苗成分：5 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），45 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐劑；加強免疫每份肽疫苗成分：10 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），40 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐劑。將充分乳化后的肽疫苗于小鼠股外側分雙側皮下注射；免疫分初次免疫和加強免疫，將第1次免疫的時間設為第0天，初次免疫時間為第0，3，6天，共3次，加強免疫為第20天，共1次。

2.B16F10細胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細胞共培養：斷頸處死加強免疫后1周的C57BL/6小鼠，取脾臟，參照小鼠淋巴細胞分離液操作說明進行脾淋巴細胞提取，將提取的淋巴細胞按照2×106/ml濃度接種于含10%FBS的RPMI 1640完全培養基中，同時加入終濃度為10 μmol/l的TRP-2180-188抗原肽和20μg/L（相當于≥100U/ml）IL-2，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養5 d。培養過程中同時進行B16F10細胞的培養與傳代，用終濃度25 mg/L絲裂霉素處理B16F10細胞，完全洗去絲裂霉素后與前述體外培養5 d的脾淋巴細胞共培養，并在倒置顯微鏡下進行觀察。

四、TIM-3對與小鼠黑素瘤B16F10細胞共培養的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴細胞的影響

1.實驗分組：按照每孔TRP-2180-188肽疫苗刺激脾淋巴細胞濃度2×106/ml、B16F10細胞濃度2×105/ml進行共培養，分組如下：空白對照組：加293T細胞培養48 h上清液；陰性對照組：加含Ig-tail（轉染pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空質粒的293T細胞培養48 h）上清液；TIM-3組：加含TIM-3（轉染pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2質粒的293T細胞培養48 h）上清液。

2.CCK-8法檢測共培養體系中淋巴細胞增殖情況：在96孔板中，參照上述分組方法（本實驗增加一組只含有293T細胞培養48 h上清液和經過絲裂霉素處理的B16F10細胞的空白組），每組設3個復孔，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基或者上清液調整每孔最終總體積為100 μl，于37℃，5%CO2培養箱中培養，分別于24 h和48 h參照CCK-8試劑盒操作說明檢測450 nm處吸光度A值并進行結果分析。細胞活力=（實驗組A值-空白組A值）/（空白對照組A值-空白組A值）×100%。48 h淋巴細胞相對24 h增殖倍數=（實驗組48 hA值-空白組A值）/（實驗組24 hA值-空白組A值）。

3.ELISA檢測各組共培養體系24 h、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情況：分別收集各組B16F10細胞與TRP-2180-188抗原肽刺激脾淋巴細胞共培養24 h和48 h的上清液，參照ELISA試劑盒操作說明檢測上清液中IFN-γ和TNF-α濃度。

4.流式細胞儀檢測共培養體系中24 h和48 h CD8+T淋巴細胞：從共培養體系中吸取懸浮的淋巴細胞并計數；將細胞300×g離心10 min，完全去除上清液；用 45 μl重懸 106細胞；加 5 μl CD8a 抗體；4℃避光孵育10 min；加1～2 ml緩沖液，300×g離心10 min，完全去除上清液；用500 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞并進行流式細胞儀檢測，用FlowJo7.6.1軟件進行分析。

五、統計學方法

結 果

一、TIM-3真核表達載體的構建及表達

將579 bp的目的片段連接至pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質粒，得到pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質粒，并對重組質粒進行EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切驗證，得到預期大小目的片段，見圖1。測序驗證結果與目標序列一致。

pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空質粒和pFUSETIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質粒轉染293T細胞后48 h，檢測培養上清液中TIM-3和Ig-tail的濃度分別為 28.46、23.12 μg/L。

圖1 pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質粒的EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切驗證 1：重組質粒（3 000 bp）；2：EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切重組質粒（酶切片段579 bp）；3：標準參照物

二、B16F10細胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細胞共培養體系構建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：經TRP-2180-188肽疫苗加強免疫后1周的C57BL/6小鼠淋巴結較未免疫小鼠增大5～6倍，脾臟較未免疫小鼠增大1.5倍，表明肽疫苗免疫成功。

2.絲裂霉素處理B16F10細胞：24 h和48 h分別在光鏡下觀察顯示：經絲裂霉素處理后B16F10細胞密度明顯低于未處理的細胞。CCK-8法檢測顯示，24 h空白組、經絲裂霉素處理組、未經絲裂霉素處理組A值分別為 0.262±0.043、0.347±0.014、0.698±0.042，48 h時分別為 0.261±0.012、0.331±0.011、1.121±0.040。24 h和48 h時，未經絲裂霉素處理的B16F10細胞A值均高于經絲裂霉素處理B16F10細胞（均P＜0.05）；經絲裂霉素處理的B16F10細胞24 h與48 h時的A值差異無統計學意義（P＞0.05）；未經絲裂霉素處理的B16F10細胞48 h時A值明顯高于24 h時（P＜0.05）。

3.TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激免疫后小鼠脾淋巴細胞：光鏡下觀察發現，未經TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激的細胞形態基本無變化，經TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激的淋巴細胞隨培養時間延長，逐漸出現集落性增殖，并且出現體積增大、胞核大、胞質豐富的細胞。見圖2。

4.B16F10細胞與TRP-2180-188肽疫苗刺激淋巴細胞共培養：隨培養時間的延長，淋巴細胞體積增大、胞核變大、胞質豐富，逐漸出現淋巴細胞向B16F10細胞周圍聚集的現象。見圖3。

圖2 光鏡下觀察免疫后小鼠脾淋巴細胞培養5 d后的形態（×40） 2A：未接受刺激細胞：細胞形態基本無變化；2B：接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激細胞：細胞集落性增殖，出現體積增大、胞核大、胞質豐富的細胞

圖3 光鏡下觀察小鼠脾淋巴細胞與B16F10共培養體系（×100） 3A：未接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激的小鼠脾淋巴細胞與B16F10共培養48 h，淋巴細胞形態無變化，向B16F10細胞周圍聚集；3B：經體外刺激的小鼠脾淋巴細胞與B16F10共培養48 h，淋巴細胞體積增大，胞核變大，胞質豐富，并向B16F10細胞周圍聚集

三、共培養體系中淋巴細胞增殖情況

24 h時空白對照組、陰性對照組、TIM-3組淋巴細胞活力（%）分別為100.00±10.42、108.70±9.90、78.06±6.37，48 h時分別為 100.00±6.24、168.00±2.98、42.93±5.93。24 h、48 h時 TIM-3組淋巴細胞活力低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。空白對照組、陰性對照組、TIM-3組48 h相對24 h淋巴細胞增殖倍數分別為3.84 0.59、5.91 0.63、2.08 0.19，TIM-3組低于空白對照組和陰性對照組（均P＜0.05）。

四、共培養體系24、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情況和CD8+T淋巴細胞

24、48 h時TIM-3組上清液中IFN-γ濃度均低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），TNF-α濃度均低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。24、48 h時，TIM-3組共培養體系中CD8+T淋巴細胞中位數高于空白對照組和陰性對照組。見表1。

表1 淋巴細胞共培養體系24 h和48 h時IFN-γ、TNF-α濃度及CD8+T淋巴細胞

討 論

TIM-3是一種負性免疫調節分子，是區分Thl和Th2細胞的表面標志，在產IFN-γ的活化T淋巴細胞中表達上調。小鼠TIM-3有全長跨膜型TIM-3（full-length membrane-anchored form of TIM-3，flTIM-3）和可溶型TIM-3（soluble form of TIM-3，sTIM-3）兩種形式。flTIM-3含有信號肽、免疫球蛋白V區、黏蛋白區、跨膜區和胞質區。sTIM-3僅含有信號肽、免疫球蛋白V區和胞質區。研究表明TIM-3還表達于Th17細胞、Treg細胞、單核巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞、肥大細胞、髓系來源抑制細胞、淋巴瘤相關的內皮細胞和某些腫瘤細胞［2-5］。凝集素家族中β半乳糖苷結合凝集素9是TIM-3的主要配體，在組織內分布廣泛，二者結合后，給T細胞提供了一種負性共刺激信號，下調免疫反應，抑制Th1介導的自身免疫反應和同種免疫反應，促進免疫耐受［6-7］。TIM-3在腫瘤組織中選擇性表達，并在多水平參與腫瘤免疫：與T細胞功能耗竭有關，參與腫瘤免疫中T細胞應答的負性調控；促進髓系來源抑制細胞的擴增，使腫瘤發生免疫逃逸，促進腫瘤發展；也可能促進樹突細胞成熟和激活自然殺傷細胞增強腫瘤免疫應答。在實體和血液系統惡性腫瘤的動物模型研究中，TIM-3在腫瘤介導的免疫抑制中起重要作用，在大部分受抑制或者功能缺陷的CD8+T細胞表達TIM-3［8-10］。阻斷TIM-3后出現與阻斷程序性死亡1（PD-1）通路相似的抗腫瘤活性［11］。阻斷TIM-3可以恢復IFN-γ、TNF-α的分泌和NY-ESO-1特異性CD8+T細胞的的增殖。以上研究提示，單獨使用TIM-3靶向免疫治療或者聯合其他方法有治療腫瘤的可能性。

本研究探討體外條件下，包含信號肽及胞外區的TIM-3融合蛋白對黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細胞影響，期望能夠提高淋巴細胞增殖及細胞因子分泌水平。但是我們的研究發現，包含信號肽及胞外區的TIM-3融合蛋白降低了黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細胞的增殖和IFN-γ、TNF-α分泌水平，分析原因可能與我們研究中合成的TIM-3融合蛋白為僅含信號肽及胞外區的TIM-3，與sTIM-3類似，而非flTIM-3。以往的研究主要應用 flTIM-3［12-13］，flTIM-3 能夠促進 Th1 細胞擴增，抑制Treg細胞增殖。目前對sTIM-3研究較少，其功能及相關機制尚不明確；有研究表明在轉染sTIM-3質粒的小鼠黑素瘤模型中，sTIM-3促進了腫瘤的生長，降低荷瘤小鼠生存時間，體外實驗顯示sTIM-3抑制T細胞對抗原特異性刺激的反應，抑制Th1細胞IL-2及IFN-γ的產生，用抗TIM-3單抗阻斷sTIM-3后可恢復T細胞功能，均提示sTIM-3抑制T細胞的功能［14］，我們的研究與該結果一致。

我們的研究中，TIM-3組CD8+T淋巴細胞高于空白對照組和陰性對照組，可能與TIM-3提高CD8+T淋巴細胞某類亞群的增殖有關，我們在后續試驗中將對T細胞表型進行進一步研究，從而探討TIM-3對T細胞增殖和分化的影響。

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Effect of T-cell immunoglobulin and mucin domain-3 on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells

Lyu Yalin,Zhou Xiaowei,Hu Bin,Wu Qiong,Zeng Xuesi,Liu Yi,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Lyu YL,Hu B,Wu Q,Zeng XS,Liu Y,Sun JF）;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Zhou XW）

ObjectiveTo evaluate the effectofT-cellimmunoglobulinandmucindomain-3（TIM-3）on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells.MethodsA recombinant plasmid pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2 encoding TIM-3 was constructed.Then,the recombinant plasmid and an empty plasmid pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2 were transfected into human 293T epithelial cells followed by 48-hour culture for the preparation of supernatants containing TIM-3 and Ig-tail respectively.C57BL/6 mice were immunized with the TRP-2180-188peptide vaccine for 4 sessions.One week after the last vaccination,C57BL/6 mice were sacrificed,and spleen lymphocytes were collected and then cultured with the TRP-2180-188peptide and interleukin-2（IL-2）for 5 days,with lymphocytes untreated with the TRP-2180-188peptide or IL-2 serving as the control group.Mitomycin-treated B16F10 murine melanoma cells and TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes were co-cultured with the presence of supernatants of 293T cells that had been cultured for 48 hours（blank control group）,TIM-3-containing supernatants（TIM-3 group）and Ig-tail-containing supernatants（negative control group）separately.After 24 and 48 hours of co-culture,cell counting kit-8（CCK-8）assay was performed to estimate the proliferative activity of lymphocytes,enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine the supernatant levels of interferon （INF）-γ and tumor necrosis factor （TNF）-α,flow cytometry to determine the percentage of CD8+T cells in the co-culture system.ResultsEnzyme digestion and sequence analysis showed that the TIM-3 gene was successfully inserted into the eukaryotic expression plasmid.After 48-hour culture,TIM-3 and Ig-tail expressions were detected in the supernatants of 293T cells transfected with the recombinant plasmid and empty plasmid respectively.As CCK-8 assay showed,the proliferative activity of lymphocytes was significantly lower in the TIM-3 group than in the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（78.06%±6.37%vs.100.00%±10.42%and 108.70%±9.90%at 24 hours,42.93%±5.93%vs.100.00%±6.24%and 168.00%±2.98%at 48 hours,allP＜0.05）,so was the ratio of cellular proliferative activity at 48 hours to that at 24 hours （allP＜0.05）.Compared with the blank control group and negative control group,the TIM-3 group showed significantly decreased supernatant levels of IFN-γ and TNF-α after 24-hour （IFN-γ：192.96±5.05 ng/L vs.216.44±7.85 ng/L and 223.67±7.79 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：58.43±0.26 ng/L vs.26.43±0.01 ng/L and 86.85±1.12 ng/L,bothP＜0.05）and 48-hour culture （IFN-γ：54.95±0.57 ng/L vs.230.06±4.23 ng/L and 167.24±3.33 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：30.23±0.26 ng/L vs.26.84±0.20 ng/L and 45.34±0.22 ng/L,bothP＜0.05）.In addition,the median percentage of CD8+T cells was significantly increased in the TIM-3 group compared with the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（3.30%vs.0.421%and 2.22%at 24 hours,4.06%vs.0.577%and 0.691%at 48 hours,allP＜0.05）.Conclusion TIM-3in vitrocan suppress the proliferative activity of and secretion of IFN-γ and TNF-α by lymphocytes,but increase the percentage of CD8+T cells in the co-culture system of TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes and B16F10 cells.

Melanoma,experimental;Vaccines,subunit;T-lymphocytes,cytotoxic;Interferon-gamma;T cell immunoglobulin and mucin domain-3

s：Liu Yi,Email：dr.liuyi@gmail.com;Sun Jianfang,Email：sunjf57@163.com

2015-05-11）

（本文編輯：尚淑賢）

劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com；孫建方，Email：sunjf57@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.002

國家自然科學基金（81171513）；江蘇省自然科學基金（BK2012506、BK20131063）；2012高等學校博士學科點專項科研基金（20121106110040）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171513）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012506,BK20131063）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China in 2012（20121106110040）