信號增強型電化學(xué)免疫傳感器用于NT-proBNP高靈敏檢測的研究*

蘇會嵐

(成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500)

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·技術(shù)與方法·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.026

信號增強型電化學(xué)免疫傳感器用于NT-proBNP高靈敏檢測的研究*

蘇會嵐

(成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500)

目的構(gòu)建用于人N末端前鈉尿肽(NT-proBNP)高靈敏檢測的電化學(xué)傳感器。方法采用自組裝方法將牛血清清蛋白-碳納米管復(fù)合物(BSA- MWNTs)固載在潔凈的玻碳電極表面，結(jié)合共價交聯(lián)固定化技術(shù)和親和素-生物素信號放大技術(shù)，制得NT-proBNP高靈敏免疫傳感器，優(yōu)化實驗條件，采用電化學(xué)方法對電極的響應(yīng)特性進行研究。結(jié)果在最優(yōu)實驗條件下，該傳感器對NT-proBNP響應(yīng)的線性范圍為1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，檢出限為0.03 ng/mL。結(jié)論該方法可實現(xiàn)對NT-proBNP的超靈敏檢測。

電化學(xué)；免疫傳感器；NT-proBNP；牛血清清蛋白；碳納米管

N 末端前鈉尿肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)，是從其氨基酸前體蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而來，含 76 個氨基酸的非活性多肽。研究證實，NT-proBNP能反映心臟功能損傷及損傷程度，目前已被作為心衰的一個特異性的疾病標(biāo)志物在臨床上廣泛應(yīng)用[1-3]。由于NT-proBNP在人血清中含量低，因此，建立一種高靈敏的NT-proBNP檢測方法在心血管疾病的早期臨床診斷中起著重要作用。NT-proBNP的常規(guī)檢測方法主要有放射免疫分析、發(fā)光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗，具有一定的靈敏度和特異性，但操作繁瑣、耗時。而基于免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測相結(jié)合的免疫傳感器技術(shù)可實現(xiàn)免疫分子的定量分析，且靈敏度高、分析速度快[4]。本研究通過將牛血清清蛋白-碳納米管復(fù)合物(BSA-MWNTs)用于構(gòu)建生物分子固載界面，通過共價鍵和固定化技術(shù)及生物素-親和素信號放大技術(shù)，研制了一種 NT-proBNP的電化學(xué)免疫傳感器，優(yōu)化實驗條件，并研究其響應(yīng)性能。

1　材料與方法

1.1儀器CHI660電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，BRANSONIC200超聲清洗儀(德國BRANSONULTRASCHALL公司)，MP230酸度計(瑞士Mettler-toledo公司)，AB204-S電子天平(瑞士Mettler-toledo公司)，格力冰柜，玻碳電極，微量進樣器，燒杯若干，50mL容量瓶，玻璃棒，洗瓶等。

1.2試劑NT-proBNP、bio-anti-NT-proBNP、牛血清清蛋白(BSA)、鏈霉親和素(SA)、多壁碳納米管(MWNTs)、EDC、NHS，0.3 μm 的Al2O3粉末，實驗室用水均為二次去離子水，鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀，pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS緩沖液等。

1.3NT-proBNP免疫傳感器的制備

1.3.1測試底液[K4Fe(CN)6/ K3Fe(CN)6溶液]用電子天秤稱取0.082 3 g的鐵氰化鉀和0.105 6 g的亞鐵氰化鉀于小燒杯中，加入pH=5.0的PBS緩沖溶液溶解，倒入50 mL容量瓶中，配成兩者各5 mmol/L的混合溶液，備用。

1.3.2BSA-MWNTs復(fù)合物的制備MWNTs使用前用濃硝酸∶濃硫酸(3∶1)80 ℃處理5 h，水洗后真空干燥。取1 mL 0.25% BSA溶液于小燒杯中，向其中加入1 mg碳納米管，振蕩，超聲半小時得到分散良好的BSA-MWNTs的復(fù)合物。

1.3.3EDC和NHS 交聯(lián)劑的制備在電子天秤上稱取0.06 g的NHS和0.08 g的EDC于50 mL的燒杯中，加入4 mL蒸餾水，用玻璃板攪拌使之完全溶解，即得EDC和NHS 各約10 mmol/L的交聯(lián)劑(此交聯(lián)劑不可久置)。

1.3.4MWNTs傳感器的制備首先，在1.0、0.3 μm 的Al2O3糊中將玻碳電極(GCE)表面拋光，用蒸餾水超聲清洗數(shù)次，最后室溫晾干。其次，將10 μL BSA-MWNTs復(fù)合物滴涂于經(jīng)預(yù)處理的電極表面，室溫晾干，再將其浸泡在EDC/NHS 溶液中，2 h之后將電極于4 ℃下與鏈霉親和素(sa)反應(yīng)5 h，再與生物素標(biāo)記的anti-NT-proBNP(bio-anti-NT-proBNP)反應(yīng)2 h。最后在0.25% BSA中封閉1 h，制得NT-proBNP傳感器。將電極置于4 ℃的冰箱中保存待用。電極制備過程示意圖，見圖1。

圖1　免疫傳感器的修飾過程示意圖

1.4檢測方法利用循環(huán)伏安法(CV)對電極的制備過程進行表征，檢測過程中飽和甘汞電極為參比電極，Pt電極為對電極，玻碳電極為工作電極，電極表征在5 mmol/L K3Fe(CN)6+5 mmol/L K4Fe(CN)6+ 0.1 mmol/L KCl + 0.1 mmol/L PBS(pH=7.0)的溶液中進行；循環(huán)伏安法電位區(qū)間為-0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s。

2　結(jié)　果

2.1不同修飾電極的電化學(xué)表征用循環(huán)伏安法研究電極在制備過程中的電化學(xué)特性，其結(jié)果見圖2。圖中曲線a為裸電極的循環(huán)伏安表征圖，可以觀察到一對氧化還原峰。曲線b為BSA-MWNTs復(fù)合納米材料修飾的玻碳電極的表征圖，從圖中可以看到，氧化還原峰電流均有降低，說明該復(fù)合納米材料成功的固載在電極表面。由于親和素、生物素、anti-NT-proBNP、BSA等生物分子都具有電化學(xué)惰性，因此曲線c、d、e、f的氧化還原峰電流均有不同程度的降低，響應(yīng)電流降低的幅度和生物分子的大小有一定相關(guān)性。綜上可證實：該免疫傳感器得以成功構(gòu)建。

a:GCE;b:BSA-MWNTs/GCE;c:sa-EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;d：bio-anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;e:BSA/bio--anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE;f:NT-proBNP/BSA/bio--anti-NT-proBNP/EDC/NHS-BSA-MWNTs-GCE。

圖2電極修飾過程的循環(huán)伏安圖

2.2實驗條件的優(yōu)化

2.2.1測試底液pH的選擇測試底液 pH 會影響電極電子傳遞效率及敏感膜的穩(wěn)定性，不適宜的pH還會影響生物分子的活性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)間的親和力降低，從而影響免疫分子的結(jié)合效率及免疫復(fù)合物的穩(wěn)定。本研究分別用pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS緩沖液配制的K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6為測試底液，用循環(huán)伏安法測試不同 pH 值下免疫電極的循環(huán)伏安曲線，從圖中得出不同pH值下的峰電流值(圖3)，其中當(dāng)pH為7.0 時，氧化還原峰電流均達(dá)到最大值。故本文選擇 pH 7.0 的 PBS 作為測試底液。

圖3　pH對峰電流的影響

圖4　孵育時間對峰電流的影響

圖5　孵育溫度對峰電流的影響

2.2.2NT-proBNP孵育時間的選擇免疫反應(yīng)完成的程度與反應(yīng)時間有關(guān)，將修飾有抗體的免疫電極放入50 ng/mL抗原溶液中，反應(yīng)不同時間(5、10、20、30、35、40 min)，用循環(huán)伏安法測定其響應(yīng)峰電流的變化，其結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，反應(yīng)30 min時，響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定，表明免疫反應(yīng)已經(jīng)完成。故實驗過程中選擇的最佳孵育時間為30 min。

2.2.3NT-proBNP孵育溫度的選擇溫度是影響免疫反應(yīng)的一個重要因素，本實驗在20～45 ℃范圍內(nèi)考察了溫度與反應(yīng)信號的關(guān)系，抗原的孵育時間均為30 min 。結(jié)果表明隨著溫度從20～45 ℃升高，響應(yīng)峰電流減小，說明抗原和抗體反應(yīng)的程度逐漸增加。在溫度較低時(20～30 ℃)，生物分子的活性較低，免疫反應(yīng)效率低，且不利于電極的穩(wěn)定性。隨著溫度逐漸升高，免疫反應(yīng)效率不斷提高，但溫度過高也會引起蛋白質(zhì)變性而失活，減少使用壽命。因此，本研究選擇孵育溫度為35 ℃，見圖5。

2.2.4免疫傳感器的響應(yīng)特性在最優(yōu)實驗條件下，分別測定了該免疫傳感器對不同濃度(1、3、5、8、10、20、30、50、80、100、150 ng/mL)NT-proBNP的響應(yīng)，見圖6。當(dāng)溶液中的抗原和電極表面的抗體特異性結(jié)合后，生成的免疫復(fù)合物為高電阻物質(zhì)，阻礙了修飾電極表面的電子傳輸，致使響應(yīng)電流下降。NT-proBNP濃度越高，敏感膜上生成的免疫復(fù)合物越多，響應(yīng)電流下降就越明顯。結(jié)果顯示：NT-proBNP線性范圍為1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，斜率分別為1.462 88和197 57，檢出限為0.03 ng/mL(性噪比3∶1)。

圖6　NT-proBNP抗原濃度與峰電流的線性關(guān)系

2.2.5免疫傳感器的選擇性研究為了考察該傳感器的選擇性，實驗同時制備6支相同的免疫傳感器，將傳感器于30 ng/mL 的BSA、CEA、PSA、HRP和10 ng/mL的NT-proBNP混合溶液孵育30 min，傳感器電極編號1、2、3、4、5、6的響應(yīng)電流(I)與干擾物質(zhì)存在時的響應(yīng)電流(I1)之間的差值△I分別為0.021、0.014、0.019、0.031、0.028、0.030 μA，說明該傳感器選擇性良好。

2.2.6免疫傳感器的重現(xiàn)性研究本研究還通過同時制備6支相同的傳感器來考察該傳感器的重現(xiàn)性。通過將這6支免疫傳感器在相同條件下孵育相同濃度抗原后行電化學(xué)檢測，電極編號1、2、3、4、5、6響應(yīng)電流分別為55.421、55.312、55.425、55.586、55.313、55.521 μA，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.98%，表明該傳感器重現(xiàn)性良好。

圖7　NT-proBNP電化學(xué)免疫傳感器與ELISA法血清樣本檢測結(jié)果相關(guān)性分析

2.2.7臨床應(yīng)用使用本研究提出的高靈敏NT-proBNP電化學(xué)免疫傳感器檢測了40例臨床血清標(biāo)本，同時采用ELISA法進行平行試驗，兩種方法的線性相關(guān)性為0.994 72(圖7)。

3　討　論

電化學(xué)免疫傳感器是將抗原抗體間的特異性識別作用與電化學(xué)分析方法結(jié)合，通過免疫反應(yīng)前后電化學(xué)信號的變化而實現(xiàn)對目標(biāo)分子的檢測。與臨床上現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光法相比，電化學(xué)免疫傳感器具有檢測速度快、響應(yīng)穩(wěn)定、操作簡便、成本低等優(yōu)勢，在疾病標(biāo)志物高靈敏檢測方面得到廣泛應(yīng)用[5-9]。

生物分子的固定化是免疫傳感器制備過程中的關(guān)鍵技術(shù)之一，是否能有效保證生物分子的活性關(guān)系到檢測結(jié)果可靠性。本實驗中采用BSA分散的MWNTs作為固定化基質(zhì)，應(yīng)用BSA的良好生物相容性[10-11]，結(jié)合生物素和生物素的固定系統(tǒng)，可有效保證電極表面固定化抗體的生物活性，這一結(jié)論通過對傳感器制備過程的表征得以證實。由于NT-proBNP在健康人血清中含量低，免疫傳感器的靈敏度是能否準(zhǔn)確檢出NT-proBNP的關(guān)鍵。MWNTs具有良好的導(dǎo)電性能及大的比表面積，有效提高電極比表面積的同時可增強電極表面的電子傳輸能力[12-13]。本研究中將MWNTs摻雜到BSA中，可有效提高電極表面的電子傳輸效率，增強電流響應(yīng)信號。同時，本研究還將生物素-親和素系統(tǒng)引入修飾電極中，可有效提高抗體的固載量，提供更多的免疫結(jié)合位點[14-15]，增強免疫傳感器的檢測靈敏度。

為了使傳感器的性能最佳，研究中對實驗條件進行了優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，測試底液pH7.0、孵育溫度35 ℃、孵育時間30 min為傳感器的最佳工作條件。在最優(yōu)實驗條件下，該免疫傳感器對NT-proBNP響應(yīng)良好，線性范圍為1～30 ng/mL和30～150 ng/mL，檢出限為0.03 ng/mL(S/n=3∶1)，表現(xiàn)出線性范圍寬、靈敏度高的特點。健康人血清中的NT-proBNP含量通常為0.1 ng/mL，心衰時可升高到2～3 ng/mL，該傳感器的線性范圍寬和靈敏度高，可以滿足實際血清樣品檢測需求。另外，本研究對免疫傳感器的選擇性和重現(xiàn)性的研究結(jié)果表明，該免疫傳感器抗干擾能力和重現(xiàn)性能優(yōu)良，可用于實際檢測。同時，將該免疫傳感器與ELISA進行臨床實際樣品的檢測對比，二者檢測結(jié)果的線性相關(guān)性好，說明免疫傳感器能準(zhǔn)確檢出血清樣本中的NT-proBNP。而普通ELISA的檢測時間長，該免疫傳感器在檢測時間上有明顯優(yōu)勢，更適于臨床快速檢測。

綜上所述，本研究提出的電化學(xué)免疫傳感器具有良好的響應(yīng)性能，具有線性范圍寬、靈敏度高、操作簡單、成本低等優(yōu)點，可實現(xiàn)NT-proBNP的高靈敏檢測，對心血管疾病患者的早期診斷提供了新的技術(shù)支撐。

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Research on the signal enhanced electrochemical immunosensor for the detection of NT-proBNP*

Su Huilan

(DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan610500,China)

ObjectiveTo construct an electrochemical immunosensor for detection NT-proBNP with high sensitivity.MethodsThe proposed immunosensor was prepared by the follows:firstly,the hybrid material BSA- MWNTs was self-assembled onto the surface of cleaned glass carbon electrode;subsequently,streptavidin was covalently linked to the modified electrode;then,biotin labeled antibody could be absorbed to the electrode by the reaction between streptavidin and biotin.The effects of experimental paramenters have been investigated.ResultsUnder the optimal experiment conditions,the prepared immunosensor displayed a wide liner relationship between 1-30 ng/mL and 30-150.0 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL.ConclusionThe NT-proBNP imunosensor can be utilized for the detection of NT-proBNP with low concentration.

electrochemistry;immuno-sensor;NT-proBNP;bovine serum albumin;carbon nanotube

國家自然科學(xué)基金資助項目(81401757)。作者簡介：蘇會嵐(1986-)，講師，博士，主要從事疾病標(biāo)志物的快速檢測方法的研究。

R446.61

A

1671-8348(2016)26-3684-04

2016-03-11

2016-05-26)