聯合應用熒光原位雜交與核型分析在產前診斷的對比研究

蔡文倩,童　靜,胡晞江,冷　培

(武漢市婦女兒童醫療保健中心生殖醫學實驗室　430016)

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聯合應用熒光原位雜交與核型分析在產前診斷的對比研究

蔡文倩,童靜,胡晞江,冷培

(武漢市婦女兒童醫療保健中心生殖醫學實驗室430016)

目的探討熒光原位雜交(FISH)和核型分析技術在產前診斷中的優勢和不足。方法在B超引導下抽取150例孕婦的羊水，用特異性探針GLP13/21和CSP18/X/Y對未培養的羊水細胞進行原位雜交；同時培養羊水細胞進行核型分析，并結果對比。結果150例羊水細胞核型分析和FISH檢測結果均成功。核型分析報告時間為10～15 d，而FISH僅為2 d。150例羊水細胞，染色體非整倍體46例，結構異常7例。FISH檢測出非整倍體45例，敏感性97.83%；未能檢測出1例X染色體部分缺失及其他結構多態性；無假陽性結果，特異性保持在100.00%。結論FISH可以快速、準確地診斷胎兒染色體數目異常，但判斷結構異常仍需核型分析。

原位雜交，熒光；染色體；核型分析；產前診斷；非整倍體

產前診斷染色體病是降低胎兒出生缺陷，提高人口素質的重要措施之一。培養羊水細胞進行傳統的染色體核型分析，是確診染色體病的重要手段，被國內外譽為診斷染色體病的金標準。但羊水細胞進行核型分析亦存在耗時長、易污染、操作繁雜、閱片困難的問題。熒光原位雜交技術以其快速、準確、靈敏度高、特異性強等優勢，在產前診斷中得到越來越廣泛的應用[1-2]。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術于20世紀80年代發展起來，其原理是將已知單鏈DNA序列作為探針，直接標記熒光素，再與靶DNA進行雜交。通過熒光顯微鏡觀察雜交后的熒光信號，對待測標本中相應核酸進行分析[3]。FISH技術于1988年被考慮應用于臨床，如今在基礎生物學領域和臨床研究領域得到了廣泛的應用[4-6]。目前，市場上已有專門用于FISH檢測13、18、21、X和Y染色體的試劑盒。與傳統染色體核型分析方法比較，FISH技術免去了細胞培養和核型分析的復雜過程，能快速、準確診斷80%的常見的染色體異常，特別適用于產前診斷。

1　資料與方法

1.1一般資料受檢者均為2013年10月至2015年10月在本院產科門診檢查并有產前診斷指征，無羊膜腔穿刺術禁忌證的孕婦，共150例。孕婦年齡18～44歲，平均(29.5±5.7)歲，妊娠17～22周。受檢孕婦產前診斷指征如下：孕婦年齡大于或等于35歲，血清唐氏生化篩查高風險，無創基因篩查高風險，不良孕產史，孕婦或其夫染色體多態性，超聲檢查胎兒異常等。羊膜腔穿刺術禁忌證包括：穿刺時具有先兆流產癥狀者，腋下體溫高于37.5 ℃，凝血功能檢查有異常，有急性盆腔或宮腔感染征象，并且無明顯指征的單純性別鑒定。所有孕婦均簽署知情同意書。

1.2羊水穿刺在超聲引導下行經腹羊膜腔穿刺術。抽取羊水27 mL，丟棄最初2 mL羊水，以減少母體細胞污染的機會。其中10 mL×2用于羊水培養行染色體核型分析，5 mL羊水直接用于FISH檢測。FISH技術診斷結果與核型分析結果進行比較。所有羊水及時送檢、及時處理。

1.3染色體核型分析方法所抽取羊水進行無菌操作。按照產前診斷技術行業標準和規范，將兩管各約10 mL的羊水樣本，2 000 r/min離心8 min，棄上清液，得細胞沉淀，分別加入Gibco 羊水培養基5 mL，輕輕吹散細胞，混勻后接種于2瓶細胞培養瓶中，分別置37 ℃、5% CO2培養箱中獨立培養。根據細胞生長狀況，細胞培養5～7 d貼壁后換液，約2 d后瓶底有大量透亮的圓細胞時加秋水仙素終止培養，酶消化收獲貼壁細胞，經離心、低滲、固定后制成細胞懸液，制片顯帶后使用美國VideoTesT-Karyo3.1全自動染色體分析系統按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2013年)》標準進行染色體核型分析。平均每例分析20個中期分裂象，分析3～5個克隆的染色體，每個克隆分析配對一個分裂象，并保存核型圖。報告時間大約需要2～3周。

1.4FISH技術檢測方法

1.4.1探針應用應用北京金菩嘉醫療科技有限公司生產的GLP 13/GLP 21位點特異性探針及CSP 18/CSP X/CSP Y染色體著絲粒特異性探針對5 mL未培養羊水直接進行FISH檢測。

1.4.2羊水細胞預處理及制片羊水細胞5 mL，2 000 r/min離心8 min，棄上清液；低滲、固定細胞，制片。

1.4.3探針雜交制片完成后，將玻片酶消化，乙醇脫水處理，然后于暗室雜交探針，將玻片置于雜交盒75 ℃水浴，雜交5 min；立即將玻片從雜交盒中拿出，轉入濕盒，42 ℃溫箱過夜；翌日，洗滌玻片以除去未雜交探針，并DAPI染色；10～20 min后觀察。

1.4.4閱片計數于熒光顯微鏡下觀察細胞及熒光信號。鏡下觀察，選擇細胞核核膜完整，背景干凈，核內雜交信號明亮清晰無重疊的細胞進行細胞及熒光信號計數。人工計數細胞核中的熒光信號，每個雜交區常規性的計數50個細胞。某指標正常細胞大于90%,提示該指標正常；某指標異常細胞大于60%，提示該指標異常；介于兩者之間應當加大計數，如實記錄異常細胞比例。

2　結　果

2.1細胞培養核型分析結果150例羊水均培養成功，報告時間10～15 d。150例產前診斷者羊水染色體檢測中，染色體數目異常者46例，其中21三體36例(含標準型34例，易位型2例)，18三體8例，X染色體缺失嵌合體1例，X染色體部分缺失1例；染色體結構異常7例，其中平衡易位3例，羅伯遜易位2例，倒位2例。受檢樣本中無13號染色體異常和Y染色體異常。

2.2FISH檢測結果150例羊水FISH檢測操作均在取樣后2 d內完成。150例產前診斷者FISH檢測中，羊水結果異常者45例，其中21三體36例，18三體8例，其結果與染色體核型分析結果相符(圖1)；1例X(52%)/XX(48%)，其對應的染色體核型分析為45,X[17]/46,X,+mar[3]，因FISH技術自身限制，其判讀結果不能作為嵌合體診斷。但有1例X染色體部分缺失，FISH方法未能檢測出。受檢樣本中無13號染色體異常和Y染色體異常。

A：21三體羊水細胞(21三體/13正常)；B：正常羊水細胞(13/21)；C：18三體羊水細胞(18三體/XX)；D：性染色體缺失(18/XO)羊水細胞；E：正常羊水細胞(18/XY)。GLP13探針定位于人類13號染色體長臂(13q14)，雜交信號為綠色(FITC)；GLP21探針定位于21號染色體長臂(21q22)，雜交信號為橘紅色(Rbodamine)。CSP 18探針定位于18號染色體18p11.1-q11.1，雜交信號為天藍色(DEAC)；CSP X探針定位于X染色體X p11.1-q11.1，雜交信號為綠色(FITC)；CSP Y探針定位于Y染色體Y p11.1-q11.1，雜交信號為橘紅色(Rbodamine)。細胞核由DAPI染色，為藍色。

圖1羊水細胞FISH檢測圖

2.3核型分析與FISH檢測結果比較將染色體核型分析結果與FISH檢測結果對比。FISH技術檢測迅速，結果判讀直觀；FISH技術檢測出染色體非整倍體異常與核型分析結果一致；但FISH技術未能檢測出染色體結構變異或多態性(圖2)。受檢樣本中，34例標準型21三體和8例標準型18三體，FISH技術全部檢測出；2例易位型21三體，FISH技術亦能檢測出，但其異位情況則不能得知。在53例染色體異常中，18、21和X非整倍體46例，占胎兒全部染色體異常的86.79%(46/53)，熒光原位雜交檢測出了45例異常(表1)。因此，由熒光原位雜交檢測染色體18、21和X非整倍體的敏感性97.83%(45/46)，特異性100.00%。

表1　羊水培養核型分析檢出結果與FISH檢出結果對比(n)

續表1　羊水培養核型分析檢出結果與FISH檢出結果對比

a：該樣本FISH技術檢測出21號染色體為三倍體異常，但未能檢測出異位。

A:典型21三體羊水細胞的核型分析與FISH結果；B:染色體結構異常圖。

圖2染色體核型分析與FISH結果

3　討　論

染色體數目變異主要源自雙親一方的配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時出現染色體不分離現象，導致該染色體增多或減少一條[7]。大部分染色體數目異常胚胎由于基因劑量效應無法發育成熟，僅有部分染色體異常的胚胎可以存活。

臨床常見的常染色體數目異常遺傳病是唐氏綜合征(21三體綜合征)，愛德華綜合征(18三體綜合征)，帕陶綜合征(13三體綜合征)，性染色體數目異常遺傳病有特納綜合征(典型核型45,X)，克氏綜合征(典型核型47,XXY)。患者往往存在生長發育、智力及生殖方面的嚴重缺陷[8-9]。

胎兒遺傳物質的核型分析是產前診斷染色體病的金標準。孕早期絨毛活檢，孕中期羊膜腔穿刺獲取羊水及臍靜脈穿刺是目前獲取胎兒遺傳物質進行細胞遺傳學分析的重要手段。其中，孕中期羊膜腔穿刺取羊水安全簡便、可行性強，在產前診斷中得到廣泛應用。羊水細胞中含有不同類型的組織細胞，主要有胎兒腎細胞與胎兒上皮細胞。妊娠16～22周，子宮已超出盆腔，易穿刺取得羊水且羊水中活細胞比例高[10]。培養羊水細胞進行核型分析，可全面觀測染色體數量及結構，直觀分析染色體缺失或易位。但細胞培養取材多、耗時長、易污染，結果判讀要求高，增加孕婦的焦慮。

近年來，也有臨床上應用微陣列-比較基因組雜交(array CGH)技術和核苷酸多態性微陣列(SNP array)技術檢測胎兒基因組，雖然分辨率高、易于自動化、特異性強，但成本高、結果判讀要求高、不能檢測出染色體平衡易位，未能在臨床廣泛推廣[11]。另外，應用高通量測序技術從母體血漿中富集胎兒游離DNA并檢測染色體非整倍體，無創安全，易于自動化，具有重大的潛在意義，但技術仍不成熟，缺乏充分的臨床實踐及證據，只能作為精確篩查技術，而不宜夸大其在產前診斷中的作用[12]。

現今，在產前診斷環節中，最常見的胎兒染色體異常發生在常染色體21、18、13和性染色體X、Y，約占產前診斷中有臨床意義染色體異常的80%。加強對13、18、21和性染色體數目異常的檢測，能有效控制胎兒先天性疾病及出生缺陷。

FISH技術在臨床上具有廣泛的應用。FISH技術檢測150例受檢羊水，均在48 h內完成報告；檢測出36例21三體(34例標準型和2例易位型)和8例18三體。與傳統細胞培養核型分析相比，FISH技術耗時短、靈敏度與特異性高、不受污染干擾、操作簡單、人工判讀結果快捷，有效提高了臨床報告的效率，減輕受檢孕婦及家屬的焦慮，并為后續治療提供及時且有效的診斷依據，實現了染色體異常的快速診斷[13]。FISH技術不僅應用于羊水樣本的檢測，對絨毛和臍血樣本也能做出快速且準確的診斷。據國內外文獻報道，FISH技術準確性、靈敏性較高，用于染色體非整倍體的產前診斷穩定可靠[5,13]。

但FISH技術也有其局限性。FISH技術不能得知2例易位型21三體樣本的易位情況，因此不能適用于染色體結構異常的檢測。FISH探針結合位點為相應染色體著絲粒處，對染色體結構異常(如倒位、易位、重復、部分缺失、著絲粒融合)等無法識別。雖然平衡易位等不一定導致明顯的臨床癥狀，但攜帶者在生育時可能會有遺傳影響[14]。而且，據文獻報道，易位型21-三體因染色體著絲粒融合，可能導致常規FISH檢測中出現假陰性[15]。有1例X染色體部分缺失樣本FISH技術未能檢測出。因為CSP X探針定位于X染色體X p11.1-q11.1，如果缺失的部分并非分布此處，則探針信號顯示完整，部分缺失不能被檢測出。所以要排除胎兒染色體結構異常，仍需要借助細胞遺傳學技術來完成。另外，應用FISH技術診斷染色體嵌合體較為棘手。FISH 能夠檢出部分嵌合體，但由于存在信號丟失和雜交效率等影響，不能作為嵌合體的判讀。FISH技術診斷染色體結構異常及染色體嵌合體需要結合染色體核型分析。

綜上所述，FISH技術對染色體非整倍體檢測快速高效，而核型分析對染色體結構異常準確可靠。FISH技術聯合核型分析是優勢互補的檢測方式，在羊水標本產前診斷中發揮越來越重要的作用。

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Prenatal diagnosis for chromosome aneuploidies in 150 amniotic fluid samples with fluorescence in situ hybridization and karyotype analysis

Cai Wenqian,Tong Jing,Hu Xijiang,Leng Pei

(LaboratoryofReprolluctiveWuhanWomenandChildrenMedicalCareCenter,Wuhan,Hubei430016,China)

ObjectiveTo investigate the Clinical Assessment of fluorescence in situ hybridization and karyotype analysis in prenatal diagnosis.Methods150 amniotic fluid specimens were collected from women with pregnancy 18 to 22 weeks by amniocentesis,and amniocytes were detected by both karyotype analysis and FISH for rapid diagnosis at the same time.Chromosome probe GLP13/21 and CSP18/X/Y were used in the FISH detection with the results of chromosome karyotype.ResultsAll of the 150 amniotic fluid specimens were detected successfully in only 2 days by FISH,while those by chromosome karyotype were detected in 10-15 days.A total of 46 cases with abnormal chromosome and 11 cases with polymorphism in chromosome structures by chromosome karyotype.FISH detection checked out 44 cases with trisomy and 1 case for mosaic 45,XO/46,XX，those were consistent with the chromosome karyotype.1 case of X-excalation and 7 cases with polymorphism in chromosome structures could not be judge.Compared with the results of karyotype analysis,the Sensitivity of FISH in aneuploid was 97.83%,and the specificity of which was 100%.ConclusionCompared with traditional karyotyping,FISH for prenatal diagnosis showed rapid and high specific characters.FISH could be used to detect fetal chromosome aneuploid diseases,but could not determine the structural abnormality of chromosome.FISH technology could not replace karyotyping completely.

in situ hybridization,fluorescence;chromosomes;karyotyping;prenatal diagnosis;aneuploidy

蔡文倩(1985-)，主管技師，博士，主要從事遺傳疾病及產前診斷的研究。

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.020

R714.55

A

1671-8348(2016)26-3662-03

2016-03-18

2016-06-16)