甲酰肽受體shRNA穩定轉染U87細胞系的構建*

楊　華，劉學英，楊風琴，楚元奎

(寧夏醫科大學臨床醫學院醫學檢驗學系，銀川 750004)

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論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.005

甲酰肽受體shRNA穩定轉染U87細胞系的構建*

楊華，劉學英，楊風琴，楚元奎△

(寧夏醫科大學臨床醫學院醫學檢驗學系，銀川 750004)

目的構建靶向甲酰肽受體(FPR)基因的shRNA 慢病毒表達載體，建立穩定轉染的U87細胞系。方法設計并合成FPR基因特異性的shRNA序列，構建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒載體，通過脂質體轉染293T細胞包裝成FPR慢病毒顆粒，感染U87細胞。熒光顯微鏡觀察轉染效果，實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法(Western blot)法檢測FPR干擾效率。結果成功構建FPR基因shRNA慢病毒表達載體。穩定轉染U87細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白。實時熒光定量PCR及Western blot證實PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒載體具有良好的干擾效果。結論成功構建FPR shRNA穩定轉染的U87細胞系。

慢病毒屬；甲酰肽受體；短發夾RNA；U87細胞

甲酰肽受體(formyl peptide receptor,FPR)屬于G-蛋白偶聯受體家族，在機體的炎癥反應和天然免疫進程中起重要的作用。N-甲酰化甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leueyl-phenylalanine,fMLF)和來源于腫瘤細胞或其他宿主細胞線粒體的一些多肽，均能通過與FPR結合，進而介導惡性腫瘤細胞的遷移和增殖，在腫瘤的發生、演進和轉移過程中可能起重要作用[1-2]。RNA干擾(RNA interence，RNAi)可特異性地阻斷靶基因表達，是研究基因功能的有效技術。本實驗設計構建并鑒定表達FPR基因的RNA 干擾靶點慢病毒載體，為進一步研究FPR在惡性腫瘤生物學行為中的影響及可能的作用機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料PDS019_pL/shRNA/GFP慢病毒載體購于上海諾百生物科技有限公司。EcoRⅠ內切酶、BsmbⅠ內切酶和T4DNA ligase均購自Fermentas公司。質粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購自Ayxgen公司。大腸埃希菌STBL3 菌種購自TaKaRa公司。LipofactamineTM2000及包裝質粒Packaging Mix購自Invitrogen 公司。293FT與U87細胞均由上海諾百生物科技有限公司提供。DMEM、胎牛血清(FBS)均購自HyClone公司。Opti-MEM購自Gibco公司。Trizol Reagent、QuantScript RT Kit、RealMasterMix(SYBR Green)均購自天根生化科技(北京)有限公司等。

1.2方法

1.2.1shRNA序列設計與合成在GenBank 中查找人類FPR的基因序列(NM_001193306.1)，其序列全長為1 371 bp，其編碼序列(coding sequences，CDS) 位于147～1 199 bp。在線軟件設計并合成3對參數最好的干擾靶序列(表1)。

表1　FPR-shRNA引物序列

1.2.2慢病毒表達載體的構建和鑒定PDS019_Pl/shRNA/GFP載體經BsmbⅠ和EcoRⅠ兩種內切酶雙酶切后切膠回收，并將退火后的3對shRNA序列與膠回收產物進行連接，連接產物轉化感受態細胞，對生長出的克隆用菌檢PCR方法檢測，然后挑取陽性克隆測序驗證。

1.2.3慢病毒載體的包裝及滴度測定將包裝質粒Packaging Mix和3種慢病毒表達質粒加入Opti-MEM混勻后與LipofectamineTM2 000共轉染293T細胞，48 h后收集細胞培養上清液并濃縮，-80 ℃保存。濃縮上清液感染HEK293細胞，熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數量。取熒光細胞數最少的2個培養孔的平均數值，分別計算滴度后取其平均值即為該病毒液滴度。病毒滴度為表達熒光的細胞數/該孔稀釋的病毒液相當于原病毒的體積。

1.2.4實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting system,RT-qPCR)檢測慢病毒FPR基因干擾效率病毒侵染293細胞48 h后，收集細胞。Trizol提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度，按試劑盒操作說明合成第1 鏈cDNA，最后以cDNA為模板進行RT-qPCR檢測，分析干擾效果，并確定最優干擾慢病毒。引物序列為FPR上游引物：5′-GGG TGA TGG CTC TGC TCC TC -3′；下游引物：5′-CGT TGG TCC AGG GCG AAA -3′；β-actin 上游引物：5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT -3′；下游引物：5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′。

1.2.5重組慢病毒感染U87細胞及穩轉細胞系的篩選培養U87細胞至對數生長期，按照孔5×105個細胞接種于6孔板，培養過夜后感染病毒。以合適的MOI的病毒液侵染靶細胞，培養4～6 h后更換新鮮的完全培養基，繼續培養24～72 h，根據細胞狀態開始進行BSD(濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12 μg/mL)篩選，篩選10 d，建立穩轉細胞系。

1.2.6RT-qPCR及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測穩轉細胞FPR基因的表達收集篩選成功的穩轉細胞，提取總RNA及總蛋白，RT-qPCR及Western blot檢測FPR基因在U87細胞中的表達情況。

2　結　果

2.1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達載體的序列鑒定將陽性表達載體進行DNA序列測定，測序結果與實驗設計的合成的FPR靶基因序列完全一致。結果表明，合成的寡核苷酸片段成功插入到慢病毒載體PDS019_Pl/shRNA/GFP中，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達載體構建成功(圖1)。

2.2shRNA慢病毒包裝和滴度測定3種PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒質粒轉染293FT細胞24 h后，熒光顯微鏡下可見大部分細胞表達綠色熒光蛋白(圖2)。3種PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒滴度分別為1.3×109、1.1×109、1.3×109TU/mL。

2.3RT-qPCR結果分析RT-qPCR數據結果顯示慢病毒侵染293T細胞48 h后，干擾效果均大于90%，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1慢病毒表達質粒的干擾效果最好。

2.4穩轉細胞系的構建與鑒定感染時將病毒按不同MOI數加入到U87細胞中，MOI=30～60時感染效率最好。用4 μg/mL BSD維持篩選建立穩轉細胞系，熒光顯微鏡下可見熒光強度達90%以上(圖3)。提取細胞總RNA及總蛋白后行Q-PCR及Western blot檢測。結果顯示，干擾穩轉細胞系中FPR基因及蛋白表達水平均低于對照組(圖4)，證明穩轉細胞系構建成功。

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1表達載體測序；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2表達載體測序；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3表達載體測序。

圖1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達載體測序結果

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3。

圖2熒光顯微鏡觀察慢病毒包裝(×100)

A:PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR；B:PDS019_Pl/shRNA/GFP-NC。

圖3熒光檢測FPR蛋白在U87細胞中的表達(×100)

A：RT-qPCR檢測FPR基因表達結果；B：Western blot檢測FPR蛋白表達結果。

圖4FPR在U87細胞中的表達

3　討　論

甲酰肽受體屬于G-蛋白偶聯受體家族，由FPR1、FPR2(FPRL1)和FPR3(FPRL2)3個成員組成[3]。在氨基酸組成上，FPR1與FPR2具有69%的同源性，FPR1與FPR3的同源性為56%[4]。FPR作為G-蛋白偶聯受體家族，能夠被不同結構的配體激活，包括肽、蛋白質和脂質。FPR與激動劑結合后，能夠觸發胞內信號級聯參與調節血管生成，細胞增殖，防止凋亡等[5-6]。fMLF是一種分泌的病原體相關分子模式(pathogen-associated-molecular patterns,PAMPs)，在細胞損傷后，可以誘導中性粒細胞和單核細胞的趨化作用[7]。fMLF作為FPR的激動劑，能介導膠質瘤細胞的趨化移動[8]。在神經膠質瘤中，FPRs可能通過自分泌或旁分泌方式與局部刺激相互作用，在促進血管生成和腫瘤生長方面起到非常重要的作用[9-10]。而且，FPR1可以反式激活EGFR，二者共同作用促進神經膠質母細胞瘤的惡性表型[10-11]。膜聯蛋白1(annexin 1,AnxA1)是FPR、FPRL1和FPRL2 3種受體的激動劑[12]，可通過激活FPRs促進膠質母細胞瘤的生長[13]、結腸直腸癌(SKCO-15細胞)的浸潤能力[14]。Cheng等[15]的研究也表明，AnxA1能夠通過FPR激活ERK/ITGB1BP1通路促進胃癌細胞的侵襲。而且在AnxA1過表達的胃癌組織中FPR1的表達顯著增加，是影響胃癌患者總體生存的獨立危險因素[16]。FPR在惡性腫瘤發生、發展和轉移中的作用越來越備受關注，有望成為腫瘤治療的新靶點之一。

為進一步研究FPR在腫瘤發生、發展及轉移中的作用，本實驗以FPR基因為靶基因，應用RNAi技術，設計3種針對FPR基因的特異性shRNA序列，構建3對慢病毒干擾載體。經PCR鑒定陽性克隆及DNA測序證實合成的寡核苷酸片段成功插入PDS019_Pl/shRNA/GFP，且插入片段與設計的靶序列一致，因此確定本實驗成功構建了3種針對FPR基因RNA干擾靶點慢病毒載體。慢病毒包裝后可成功轉染至293T細胞中，通過RT-qPCR證實，設計包裝的3種序列的慢病毒載體均可明顯干擾293T細胞中的FPR基因表達，其中PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1序列沉默表達效果最佳。本研究成功構建FPR基因慢病毒干擾載體，并建立了FPR shRNA穩定轉染的U87細胞系，為進一步研究FPR在人膠質瘤中的作用及作用機制奠定了實驗基礎。

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Construction of U87 cell line transfected by FPR shRNA*

Yang Hua,Liu Xueying,Yang Fengqin,Chu Yuankui△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,ClinicalMedicineSchoolofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo construct shRNA lentiviral vector for FPR gene,and establish stable transfection of U87 cell lines.MethodsThe shRNA sequences for FPR gene was synthesized and inserted into PDS019 lentiviral vector.Liposome was used to package PDS019 lentiviral particles into 293T cells and used to infect U87 cells.The green fluorescent protein (GFP) and the silencing effects of the recombinant vectors were detected with the fluorescence microscope and Q-PCR,Western blot.ResultsThe recombinant vectors were successfully constructed.In the U87 cells transfected with the recombinant vectors,the expression of GFP were detected and the interference efficiency of the recombinant vectors were confirmed.ConclusionThe constructed FPR shRNA lentiviral vectors could interfere the expression of FPR in U87 cells.

lentivirus;FPR;shRNA;U87 cells

國家自然科學基金資助項目(81301499,81460324)。作者簡介：楊華(1974-)，副教授，博士，主要從事腫瘤發生的分子機制及臨床作用研究。△

，E-mail:chuyuankui@163.com。

R730.2

A

1671-8348(2016)26-3616-03

2016-02-14

2016-04-06)