金骨蓮膠囊對兔膝骨關節炎軟骨保護作用的研究*

王勝民,劉　毅△，劉　波,桑　鵬，仲鶴鶴，孫鵬鵬

(1．遵義醫學院附屬醫院骨一科，貴州遵義 563000；2.濟仁骨科醫院關節外科，貴州銅仁 555200)

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論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.004

金骨蓮膠囊對兔膝骨關節炎軟骨保護作用的研究*

王勝民1,劉毅1△，劉波2,桑鵬1，仲鶴鶴1，孫鵬鵬1

(1．遵義醫學院附屬醫院骨一科，貴州遵義 563000；2.濟仁骨科醫院關節外科，貴州銅仁 555200)

目的研究中藥金骨蓮膠囊對兔膝骨關節炎(OA)關節軟骨中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平的影響，探討其可能作用機制。方法40只家兔分為4組：空白對照組(10只)、模型對照組(10只)、金骨蓮膠囊組(10只，74.4 mg·kg-1·d-1)、氨基葡萄糖組(10只，150 mg·kg-1·d-1)。除空白對照組外其余均按改良Hulth法復制OA模型，術后當天開始藥物灌胃，對照組僅灌服等量生理鹽水，1次/天，連用8周。8周后處死家兔取右膝股骨髁及脛骨平臺大體觀察。采用Mankin評分評價關節軟骨退變情況；采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測股骨內側髁負重區關節軟骨IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量。結果空白對照組、金骨蓮膠囊組、氨基葡萄糖組和模型對照組Mankin評分分別為(1.380±0.183)、(2.580±0.464)、(5.250±0.143)、(10.380±0.183)分，Mankin評分依次升高，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組3種炎性因子mRNA表達量均明顯低于模型對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；中藥金骨蓮膠囊在下調IL-1βmRNA方面與氨基葡萄糖作用相當，差異無統計學意義(P=0.271)。金骨蓮膠囊在降低IL-6和TNF-α mRNA方面優于氨基葡萄糖作用，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論中藥金骨蓮膠囊可不同程度下調關節軟骨中IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的表達，使軟骨退變的部分因素得到控制，從而起到保護關節軟骨的作用。

骨關節炎；白細胞介素-1β；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；金骨蓮膠囊

隨著社會老齡化,骨關節炎(osteoarthritis，OA)的發生率逐漸升高[1]。OA是以關節軟骨的退變、破壞及骨贅形成為主要特征的慢性關節病[2]。西醫治療OA主要是藥物、玻璃酸鈉注射、手術等治療，臨床上藥物治療主要以氨基葡萄糖為代表來保護關節軟骨。OA在祖國醫學中屬“痹癥”范疇[3]，肝腎虧損、風寒濕邪、痰淤痹阻為其主要病因；民間治療OA的藥物多為傳統中草藥組方，效果顯著，因此挖掘傳統中草藥治療OA是目前研究的焦點。傳統中藥金骨蓮膠囊是一個經典苗藥組方，主要由透骨香、漢桃葉和金鐵鎖等制成，具有消炎、鎮痛、軟骨基質保護等療效[4]。目前對金骨蓮膠囊的研究大多為其化學成分、藥理作用、組織培養等，關于其對OA的保護作用少見報道。2015年1～12月，筆者觀察了中藥金骨蓮膠囊對兔膝OA的軟骨保護作用，并探討其可能作用機制。

表1　引物序列

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及儀器健康成年家兔40只，清潔級，體質量2.3～2.9 kg，雌雄不限，由遵義醫學院動物實驗基地提供；SM2000R型病理組織切片機(德國Leica公司)，Olympus LX71-A21PH光學顯微鏡(北京世紀科信科學儀器有限公司)，MICRO 21R型高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司)，ND1000型核酸蛋白測量儀(美國Nanodrop公司)，C1000型PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，iCycler iQ熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.1.2主要藥物及試劑ZP404離心柱型動物組織/細胞總RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)，實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)均購于日本TaKaRa公司。金骨蓮膠囊(批號：150707，規格：0.25 g×24粒/盒，貴州益佰制藥股份有限公司)，鹽酸氨基葡萄糖片(批號：150905，規格：0.75 g×6片×2片/盒，江蘇正大清江制藥有限公司)，EDTA脫鈣液(pH=7.2，北京Solarbio公司)。

1.2方法

1.2.1分組及造模40只健康成年家兔適應性喂養5 d后分為4組：空白對照組、模型對照組、金骨蓮膠囊組、氨基葡萄糖組，每組10只。除空白對照組外其余均改良Hulth法造模[5-7]。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉28 mg/kg，術區備皮，常規消毒，行右膝內側切口，暴露右膝關節腔，切除前交叉韌帶及內側半月板，行抽屜實驗確認前交叉韌帶已完全斷裂；縫合關節腔及皮膚。術后每組每天肌肉注射青霉素鈉(20 MU/kg)，連用6 d。單籠飼養并每日驅趕1.5 h。

1.2.2動物給藥及取材按照《藥理實驗方法學》體表面積計算方法來折算給藥劑量，兔等效劑量為人劑量3.1倍，金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組對應劑量74.4、150.0 mg·kg-1·d-1，總量均為20 mL，分別于造模當天藥液灌胃；空白對照組和模型對照組僅灌服等量的生理鹽水，1次/天。術后8周空氣栓塞處死家兔并取兔右膝股骨髁及脛骨平臺，生理鹽水沖洗干凈大體觀察后分別放于液氮(-196 ℃)及10%福爾馬林固定，備用。

1.2.3關節軟骨Mankin評分標準[8-9]蘇木精-伊紅(HE)染色：(1)軟骨結構評分，關節軟骨結構光整如常，0分；軟骨結構表面不規則裂隙，1分；軟骨血管翳形成，2分；裂隙深達移形層，3分；裂隙深達放射層，4分；裂隙深達鈣化層，5分；軟骨全層脫落，6分。(2)細胞數量評分，軟骨細胞數量如常，0分；數量彌漫性增多，1分；出現大量簇集樣細胞團，2分；數量逐漸減少，3分。番紅染色：(1)基質評分，關節軟骨基質染色正常，0分；染色輕度減退，1分；染色中度減退，2分；染色重度減退，3分；關節軟骨基質不著色，4分。(2)潮線評分，關節軟骨潮線完整，0分；多重潮線，1分。

1.2.4HE和番紅染色10%福爾馬林固定右膝脛骨平臺7 d，繼續用EDTA脫鈣液脫鈣30 d。常規脫水、剝離關節軟骨、石蠟包埋、行5 μm厚度切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ梯度脫蠟，乙醇梯度水化。HE染色：蘇木精染色6 min，鹽酸乙醇分化15 s，伊紅染色5 min；番紅染色：番紅染色5 min。二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。根據Mankin評分標準評估軟骨退變情況。

1.2.5IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的檢測[10]總RNA的提取：液氮環境下剝離及研磨關節軟骨，嚴格按照試劑盒說明書操作提取RNA，用ND1000型核酸蛋白測量儀測RNA濃度和純度。cDNA的合成：按照5×Prime Script Buffer(for Real Time) 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL,Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，總RNA 6μL，Rnase Free ddH2O 7 μL；總反應體系20 μL，在37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，4 ℃ Forever的條件下逆轉錄成cDNA。基因擴增：以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，嚴格按照SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行)；反應體系：Rnase Free ddH2O 6.4 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×) 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物(上海生工公司合成，表1)各0.8 μL，總體積20.0 μL；擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40次。實驗數據采用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需PCR的循環數)分析IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量。

2　結　果

2.1膝關節大體情況空白對照組右膝關節無腫大，體質量無明顯增減，關節軟骨透明，表面光滑、平整，色澤正常。模型對照組右膝關節腫脹明顯，體質量明顯減輕，關節軟骨表面粗糙，部分可見明顯骨贅形成，色澤灰暗，部分軟骨剝脫并顯露軟骨下骨。金骨蓮膠囊組右膝關節稍腫脹，體質量減輕不明顯，關節軟骨表面稍粗糙，未見明顯骨贅形成，色澤稍灰暗。氨基葡萄糖組右膝關節腫脹輕于模型對照組，體質量稍微減輕，關節軟骨表面欠光澤，部分可見極少量骨贅形成。見圖1。

2.2關節軟骨退變情況空白對照組關節軟骨結構光整，細胞數量如常，基質染色正常，潮線完整。模型對照組軟骨表面較粗糙，有不規則裂隙形成，細胞數量明顯減少，基質中度或重度失染，潮線不完整。金骨蓮膠囊組關節軟骨表面稍粗糙，局部見裂隙，細胞數量輕度減少，基質染色輕度減退，潮線欠完整。氨基葡萄糖組軟骨表結構欠光整，局部見不規則裂隙，細胞數量減少，基質染色輕、中度減退，潮線欠完整。HE、番紅染色見圖2。關節軟骨Mankin評分數據分析顯示，模型對照組比空白對照組關節軟骨退變嚴重，差異有統計學意義(P<0.05)；金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組分別與模型對照組比較，差異均有統計學差異(P<0.05)；金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3兔膝關節軟骨中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量所有擴增曲線均無非特異性熒光，融解曲線呈單峰，產物特異性好。見表2。OA模型IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量，模型對照組3種炎性因子均明顯高于空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明復制OA模型成功；金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組3種炎性因子表達量均明顯低于模型對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明兩種藥物均有不同程度軟骨保護作用；中藥金骨蓮膠囊在降低IL-1βmRNA方面作用與氨基葡萄糖相當，差異無統計學意義(P>0.05)。中藥金骨蓮膠囊在降低IL-6和TNF-αmRNA方面作用優于氨基葡萄糖，差異均有統計學意義(P<0.05)。

A:空白對照組；B：模型對照組；C：氨基葡萄糖組；D：金骨蓮膠囊組。

圖1各組兔膝關節大體標本圖

圖2　各組關節軟骨HE染色(×200)和番紅染色(×200)

組別Mankin評分(分)IL?1βIL?6TNF?α空白對照組1．380±0．1831．000±0．3001．000±0．3001．000±0．300模型對照組10．360±0．183a8．420±0．785a12．600±0．226a10．800±0．521a金骨蓮膠囊組2．580±0．464abc2．550±0．169ab5．020±0．216abc2．580±0．464abc氨基葡萄糖組5．250±0．143ab2．350±0．031ab7．430±0．114ab5．250±0．143abF155．40067．280842．700146．000P0．0000．0000．0000．000

a:P<0.05,與空白對照組比較；b:P<0.05,與模型對照組比較；c:P<0.05,與氨基葡萄糖組比較。

3　討　論

膝OA是多種生物因素與機械損傷因素相互作用所致生物力學紊亂而引起的病理改變，中老年人多發[11]。多項研究表明，成功造模后的膝OA炎癥變化包括關節液滲出及滑膜增生，這也許是OA患者關節疼痛的重要機制之一[12-13]。OA模型的建立是本實驗成功的前提，故采用改良Hulth法復制OA模型。關節軟骨Mankin評分得出模型對照組較空白對照組軟骨退變嚴重，提示造模成功。研究證實，氨基葡萄糖在治療膝OA中效果肯定，在本實驗中作為陽性藥物對照[14]。

從大體標本角度出發得知，金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組均比模型對照組的關節軟骨表面光整，并沒有明顯骨贅形成；中藥金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組肉眼觀沒有明顯差別。從病理組織學角度得知，金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組均比模型對照組的關節軟骨結構規則、細胞數量多、基質輕度失染、潮線完整，說明兩種藥物均有不同程度軟骨保護作用；金骨蓮膠囊組和氨基葡萄糖組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明在病理組織學水平上金骨蓮膠囊療效優于氨基葡萄糖。

IL-1β、TNF-α在OA病程中均是典型的致炎細胞因子[15-16]，可通過一系列級聯反應引起關節軟骨的破壞和炎癥反應，在膝OA中呈高表達，并與病情呈正相關[17]。IL-1β可調節蛋白水解酶的合成與分泌，促進軟骨細胞和滑膜細胞分泌基質金屬蛋白酶并加速膠原蛋白及聚蛋白多糖的降解[18]。近期研究表明，金骨蓮膠囊能夠降低類風濕性關節炎大鼠血清中的IL-1β、TNF-α，因此推測金骨蓮膠囊抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α是治療類風濕關節炎的機制之一[19]。本實驗發現，金骨蓮膠囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下調膝OA中IL-1β、TNF-α炎癥因子，但是金骨蓮膠囊在降低IL-1βmRNA方面作用與氨基葡萄糖相當，差異無統計學意義(P>0.05)，而在降低TNF-αmRNA方面作用優于氨基葡萄糖，差異有統計學意義(P<0.05)。

IL-6在OA中的作用仍存在很大爭議。有研究認為，在OA 中晚期的關節軟骨中有過量的IL-6表達[20-21]，進而刺激更多的基質金屬蛋白酶(MMP)表達[22-23]，大量軟骨基質被降解，軟骨進一步加重。最新研究表明，IL-6可能是TNF-α和IL-1β作用于其他細胞重要的中介物質；TNF-α和IL-1β通過IL-6的產生將OA的疾病進程放大與延續，三者的協同作用可加速OA的進展[24]。IL-6在OA軟骨下骨成骨細胞中表達較高，并與OA軟骨破壞緊密相關[25]。有研究表明，IL-6也可以刺激產生金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)，從而負反饋抑制MMP，因此可認為IL-6在OA中影響是雙向的[26]。從分子水平得知，中藥金骨蓮膠囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下調膝OA中IL-6炎癥因子，但是中藥金骨蓮膠囊作用優于氨基葡萄糖，差異有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，中藥金骨蓮膠囊和氨基葡萄糖均可不同程度的下調膝OA中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子，而中藥金骨蓮膠囊在降低IL-6和TNF-α mRNA方面作用優于氨基葡萄糖；從而達到中藥金骨蓮膠囊抑制軟骨基質破壞和延緩關節軟骨退變的目的，對關節軟骨起保護作用。

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Experimental study on protective effects of psammosilene tunicoides on knee osteoarthritis in rabbits*

Wang Shengmin1,Liu Yi1△,Liu Bo2,Sang Peng1,Zhong Hehe1,Sun Pengpeng1

(1.DepartmentofOrthopaedics,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China;2.DepartmentofJointSurgery,JirenHosptialDepartmentofOrthopedics,Tongren,Guizhou555200,China)

ObjectiveStudy of Golden Lotus capsule and psammosilene tunicoides protective of knee osteoarthritis in domestic rabbits.MethodsA total of 50 healthy domestic rabbits were randomly and equally divided into A,B,C,D,E group,group A was the control group,group B:model control group,group C to give the drug of Psammosilene tunicoides,D group to give Golden Lotus capsule,group E to give the glucosamine drug(n=10).Except for A group,the other 4 groups of domestic rabbits were induced right knee osteoarthritis models by the modified Hulth′s modeling method.After modeling,the experimental group began taking the drug,A and B group were fed with normal saline,once a day.All rabbits were kills by gas embolism at the eighth week.The articular cartilage of medial malleolus of femur split into two and the right knee joints were obtained.One hematoxylin eosin staining and safranin o staining Mankin score of articular cartilage,the other with real-time fluorescent quantitative PCR technique to detect articular cartilage of IL-1β,IL-6 and TNF-α of the mRNA relative expression level.ResultsMankin score of group A,B,D and E were(1.38±0.183),(2.58±0.464),(5.25±0.143)and(10.38±0.183)respectively,and it increased in order(P<0.05).mRNA expression of group D and E were significantly lower than group B(P<0.05).Psammosilene tunicoides,Golden Lotus capsule and glucosamine have different levels of protection effect for IL-1β,IL-6 and TNF-α in the articular cartilage of medial malleolus of femur.Compared with control group,the difference between Psammosilene tunicoides and Golden Lotus capsule groupthe was statistically significant (P<0.05).ConclusionPsammosilene tunicoides and Golden Lotus capsule could decrease the expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 in different degree.

osteoarthritis;Interleukin-1β;Interleukin-6;tumor necrosis factor alpha-α;golden lotus capsule

貴州省科技廳社發攻關基金資助項目(黔科合SY[2010]3091號)；碩士啟動基金項目(院字[2013]20號)。作者簡介:王勝民(1988-)，碩士，主要從事骨關節炎及關節鏡的研究。△

,E-mail:13308529536@163.com。

R684.3

A

1671-8348(2016)26-3611-05

2016-03-05

2016-05-26)