欽州市欽南區HIV-1流行亞型及基因變異特征研究*

沈　平，蘇齊鑒，黃毅毅，蔣麗萍，張達燕，郭繼昌，徐鴻莊，韋建立

(1．廣西壯族自治區欽州市欽南區疾病預防控制中心　535000；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 530011)

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·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.002

欽州市欽南區HIV-1流行亞型及基因變異特征研究*

沈平1，蘇齊鑒2△，黃毅毅1，蔣麗萍1，張達燕1，郭繼昌1，徐鴻莊1，韋建立1

(1．廣西壯族自治區欽州市欽南區疾病預防控制中心535000；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 530011)

目的調查流行于欽南區的HIV-1亞型種類并分析其基因變異特征。方法抽取100例未抗病毒治療的HIV-1感染者，從血樣中提取病毒RNA或前病毒DNA，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增HIV-1 gag基因和pol基因片段并測序，用系統進化樹分析其亞型，并計算gag和pol區的基因離散率。結果97份血樣獲得gag基因序列或pol基因序列，4份血樣的gag與pol分型不一致，其他93份分型明確，其中CRF01_AE重組型、CRF07_BC重組型、CRF08_BC重組型及G亞型分別占76.34%(71/93)、9.68%(9/93)、12.90%(12/93)和1.07%(1/93)。CRF08_BC的gag基因離散率為0.059±0.005，高于CRF07_BC的0.053±0.005(P<0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P<0.01)。CRF01_AE的pol基因離散率為0.044±0.003，高于CRF07_BC的0.035±0.004(P<0.01)和CRF08_BC的0.033±0.003(P<0.01)。結論欽南區HIV-1存在至少3種流行亞型，其中CRF01_AE是最主要的亞型，不同基因區的變異程度有所不同。

HIV-1；基因,gag；基因,pol；亞型；離散率；變異

自2010年起，廣西實施的為期5年的艾滋病攻堅工程已初顯成效，研究顯示2008～2013年新報告的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、艾滋病患者呈現出先上升后下降的趨勢，而晚發現比例仍然呈逐年上升趨勢[1]。雖然廣西新報告的艾滋病病例在2011年之后有所下降，但是此下降趨勢在欽州市的某些地區并不明顯[2]。欽州市是廣西北部灣沿海正在建設的新興城市之一，交通便利，艾滋病的流行因素廣泛存在，艾滋病防治形勢嚴峻。為了解該地區的HIV-1分子流行病學特征，本研究以欽州市欽南區未治療艾滋病感染者為研究對象，對HIV-1的 gag和pol基因進行分析，探討流行于該地區的HIV-1亞型，并分析其基因變異情況。

1　資料與方法

1.1一般資料在艾滋病綜合防治數據管理系統中查詢欽南區所有未經抗病毒治療的HIV感染者，在查詢到的361例中，利用隨機數字表抽取100例，轄區內12個鄉鎮均有病例被抽中。對抽中的研究對象進行流行病學資料并抽取外周靜脈血10 mL。

1.2方法

1.2.1病毒核酸提取分離血漿和血細胞，保存于-80 ℃冰箱。用RNA 提取試劑盒 (high pure viral RNA kit，Roche公司產品)從血漿中提取病毒RNA。當PCR擴增或測序失敗時，用全血基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊公司)由血細胞提取前病毒DNA。

1.2.2gag和pol區基因序列擴增前病毒DNA通過巢式PCR分別擴增gag和pol基因，RNA經逆轉錄后進行巢式PCR。gag和pol區擴增引物及反應條件參照文獻[3-4]。

1.2.3擴增產物鑒定與測序第二輪擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，對出現目的條帶的PCR擴增產物進行DNA測序，其中，gag區產物送北京天一輝遠生物公司測序，pol區產物送至北京博邁德生物公司進行測序。

1.2.4序列亞型分析與系統進化樹分析序列經拼接、校正，用在線亞型分析工具Genotyping(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/)對序列進行亞型分析，用 MEGA 5.03 軟件構建鄰接系統進化樹(重復運算 1 000 次)分析亞型和計算基因離散率(堿基替代模型為Kimura-2 parameter model)，進化樹拓撲結構用Bootstrap法檢驗。gag和pol區參考序列來自HIV Database(http://www.hiv.lanl.gov)。

1.3統計學處理所有數據用SPSS 16.0進行處理。不同亞型基因離散率的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1流行病學資料3例研究對象的血樣因嚴重溶血而排除，最后納入97例。研究對象年齡9～89歲，其中20～49歲占62.8%；男性占67.0%；異性性傳播占86.60%；職業以農民、工人及民工為主。CD4細胞計數平均為每微升415個。見表1。

表1　研究對象的流行病學資料

2.2基因亞型鑒定及分布在97份血樣中，獲得72株HIV-1的gag基因序列和95株HIV-1的pol基因。對序列進行Genotyping分型及進化樹驗證(圖1、2)，規定某樣本在gag基因和pol基因的分型中一致，或僅在1個基因測得其分型，則可確定其分型，若兩基因分型不一致則不進行進一步分析。結果4份血樣gag基因分型與pol基因分型不一致，其他93份血樣Genotyping分型明確(表2)，其中，CRF01_AE占76.34%(71/93)，CRF07_BC占9.68%(9/93)，CRF08_BC占12.90%(12/93)，G亞型占1.07%(1/93)。本研究獲得的G亞型毒株(QN100)與在廣西發現的首例G亞型毒株(G.CN.2008.GX_2084_08.JN106043)成簇，Bootstrap達100%。

圖1gag基因序列的系統進化樹分析

圖2pol基因序列的系統進化樹分析

表2　HIV-1基因亞型分布

2.3基因離散率CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC在gag及pol區的離散率見表3。經方差分析，gag基因離散率差異有統計學意義(P<0.01)；SNK檢驗顯示，CRF08_BC的gag基因離散率大于CRF01_AE(P<0.01)和CRF07_BC(P<0.01)。3種重組型的pol基因離散率的差異也有統計學意義(P<0.01)；SNK檢驗顯示，CRF01_AE的離散率大于CRF07_BC(P<0.01)和CRF08_BC(P<0.01)。

表3　HIV-1 gag基因及pol基因的基因離散率

a：q=9.79，P<0.01，與CRF01_AE比較；q=4.61，P<0.01，與CRF07_BC比較。b：q=11.62，P<0.01,與CRF07_BC比較；q=16.09，P<0.01,與CRF08_BC比較。

3　討　論

據文獻報道，截至2009年，我國HIV-1流行亞型最多的是CRF01_AE(占30%)[5]。CRF01_AE也是近年來廣西最主要的流行亞型，所占比例超過70%[6-8]。本次調查發現欽南區有CRF01_AE重組型(76.34%)、CRF07_BC重組型(9.68%)、CRF08_BC重組型(12.90%)和G亞型(1.07%)，亞型分布特點與廣西其他地區相似。從歷年的監測數據來看，CRF01_AE所占的比例在廣西地區呈逐步上升的趨勢。經分析，CRF01_AE的廣泛流行可能與其Gp120蛋白獨特的N連接糖基化位點分布有關，該毒株的N連接糖基化位點(PNGSs)總數量尤其在V2和V4區的數量明顯較其他亞型的毒株少，而V5區的N連接糖基化位點數量又明顯更多[9]。N連接糖基化具有維持Gp120蛋白的三級結構和回避宿主免疫攻擊的作用，并且有可能影響HIV-1病毒的傳染性[10-11]。

經查閱文獻發現，G亞型在國內較為罕見，只有個別報道[12-13]。2008年廣西發現的G亞型感染病例是北海市的1例靜脈吸毒者[14]；本研究中發現的唯一1例G亞型樣本與該毒株形成一簇，Bootstrap達100%。根據流行病學調查資料，本研究發現的G亞型感染病例及其配偶未曾在北海發生過高危行為，提示G亞型可能已經在北海和欽州的某些人群中小范圍流行。

系統樹分析發現4份樣本的gag和pol基因區分型結果不一致。其中，QN005的gag區為CRF08_BC亞型，pol區為CRF01_AE區；QN058的gag區為CRF07_BC區，pol區為CRF08_BC；QN068的gag區為CRF07_BC區，pol區為CRF08_BC區；QN073的gag區為CRF07_BC區，pol區為CRF01_AE區。考慮到HIV-1高度的變異性和活躍的重組特性，分型的不一致可能是由于所感染的毒株發生了新的重組。

基因離散率分析通過計算序列間的變異程度來估計HIV-1在當地流行時間的長短。本研究發現，在gag區，CRF08_BC的基因離散率高于CRF07_BC和CRF01_AE，而在pol區，CRF01_AE的基因離散率高于CRF07_BC和CRF08_BC。兩基因區離散率不一致的原因有待進一步分析，不排除兩個基因區得到的序列數量不一致對此造成的影響。本研究的pol基因區離散率分析結果與王敏連等[15]的研究相吻合，目前各種證據比較傾向于CRF01_AE是廣西流行時間最早的HIV-1毒株之一，而且目前已經成為不同傳播途徑的最主要流行亞型。

本次調查覆蓋了轄區內所有鄉鎮，而且各鄉鎮的民族構成、生活方式和地方習俗等，以及影響艾滋病流行的因素基本一致，因此，抽取的樣本有較好的代表性。本次調查獲得了欽南區HIV-1分子流行病學特征的第一手資料，為追溯當地艾滋病的流行史和演變趨勢，了解艾滋病的流行現狀，以及為今后開展HIV-1流行監測提供了基礎數據，這對于當地的艾滋病防控工作有重要的指導作用。

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HIV-1 subtype distribution and genetic variation in Qinzhou South district of Qinzhou city*

Shen Ping1,Su Qijian2△,Huang Yiyi1,Jiang Liping1,Zhang Dayan1,Guo Jichang1,Xu Hongzhuang1,Wei Jianli1

(1.QinzhouSouthDistricCenterforDiseasePreventionandControl,Qinzhou,Guangxi535000,China;2.AffiliatedRuikangHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning,Guangxi530011,China)

ObjectiveTo investigate HIV-1 subtypes circulating in Qinzhou South District and understand the features of genetic variation of the virus.MethodsBlood samples were collected from 100 HIV-1 antiretroviral treatment(ART)-patients from Qinzhou South District of Qingzhou city.Viral RNA and proviral DNA was extracted and amplified.The gag and pol gene fragments of HIV-1 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and were sequenced,then phylogenetic tree was constructed and genetic distance was calculated for each genetic region.ResultsGag or pol gene sequences were successfully amplified from blood samples.4 samples had different subtyping results in the two genetic region.There were 76.34% of CRF01_AE(71/93),9.68% of CRF07_BC(9/93),12.90% of CRF08_BC(12/93) and 1.07% of subtype G(1/93).The genetic distance of the gag gene for CRF08_BC was 0.059±0.005，higher than CRF07_BC (0.053±0.005,P<0.01) and CRF01_AE (0.049±0.004,P<0.01).But in the pol gene,the distance for CRF01_AE was 0.044±0.003,higher than CRF07_BC (0.035±0.004,P<0.01) and CRF08_BC (0.033±0.003,P<0.01).ConclusionThere are at least three subtypes circulating in Qinzhou South District,and CRF01_AE is the most predominant strain.The levels of genetic variation are different in the two genetic regions.

HIV-1;gene,gag;gene,pol;subtype;genetic distance;variation

國家自然科學基金資助項目(81360258)；欽州市欽南區科技局資助項目(20140101)。作者簡介：沈平(1956-)，主任醫師，本科，主要從事流行病學研究。△

，E-mail:agansue@163.com。

Q786

A

1671-8348(2016)26-3605-03

2016-02-21

2016-05-06)