miR-335通過靶向生存素對乳腺癌細胞增殖的調控作用

黃雅娟，杜　峰，魏玲麗

(江西省婦幼保健院乳腺科　330006)

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miR-335通過靶向生存素對乳腺癌細胞增殖的調控作用

黃雅娟，杜峰，魏玲麗

(江西省婦幼保健院乳腺科330006)

目的探討miR-335通過靶向生存素對乳腺癌細胞增殖的調控作用。方法(1)選取乳腺癌組織及癌旁正常組織，分別采用RT-PCR、Western blot檢測組織中miR-335及生存素蛋白表達。(2)選取乳腺癌細胞系MCF-7，分別轉染miR-335 mimic及mimic對照組，采用RT-PCR、Western blot檢測組織中miR-335及生存素蛋白表達。(3)選取乳腺癌細胞系MCF-7，分別將野生型survivin 3′-UTR質粒(survivin-wt)和突變型survivin 3′-UTR質粒(survivin-Mut)與miR-335 mimic或模擬物陰性對照(NC)共轉染至乳腺癌細胞系MCF-7，雙熒光素酶報告基因檢測細胞熒光素酶活性。(4)選取乳腺癌細胞系MCF-7，分別轉染mimic對照組、miR-335 mimic及miR-335 mimic+survivin，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞增殖活性。結果(1)與癌旁組織相比較，乳腺癌組織中miR-335表達顯著降低(P<0.05)，同時生存素蛋白表達顯著增高(P<0.05)。(2)與轉染mimic對照組相比較，轉染miR-335 mimic可使乳腺癌細胞MCF-7中miR-335表達上調(P<0.05)，同時生存素蛋白表達表達下調(P<0.05)。(3)與轉染NC相比較，共轉染miR-335 mimic與survivin-wt可使MCF-7熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉染miR-335 mimic與survivin-Mut則MCF-7熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05)。(4)轉染miR-335mimic后，MCF-7增殖活性較轉染mimic對照組顯著降低(P<0.05)；而轉染miR-335 mimic+survivin后，MCF-7增殖活性較單純轉染miR-335 mimic顯著提高(P<0.05)，但仍顯著低于轉染mimic對照組(P<0.05)。結論在乳腺癌組織中miR-335呈現低表達，生存素呈現高表達；而miR-335可通過靶向生存素抑制乳腺癌細胞系MCF-7增殖。

微RNAs;乳腺腫瘤；細胞增殖；miR-335；生存素

近年來，我國乳腺癌發病率逐年上升，并有年輕化發展趨勢[1]。乳腺癌根治術是治療早期乳腺癌的可靠手段，但由于起病隱匿，大多數患者臨床確診時已為晚期，從而錯失實施根治手術的最佳時機。包括放療、化療及內分泌治療在內的輔助治療手段雖已廣泛應用于乳腺癌臨床治療，但其所致的毒副反應及耐藥性也不容忽視[2]。因此，尋求更安全、高效的乳腺癌治療方法是臨床亟待解決的重點及難點問題。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非編碼小分子RNA，其可通過調控一個或多個靶基因翻譯，參與惡性腫瘤的發生與發展[3]。miR-335定位于人類7q32.2[4]。研究證實，乳腺癌細胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231中miR-335表達均顯著低于正常乳腺細胞系MCF-10A(P<0.05)，而過表達miR-335則可對乳腺癌細胞生物學特性產生影響，提示miR-335可能參與乳腺癌的進展過程[5]。但miR-335對其下游靶基因的調控作用及機制尚未明確。Yang等[6]研究發現，miR-335可通過靶向生存素(survivin)實現對胃癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的抑制。而miR-335靶向生存素對乳腺癌的影響尚未可知。針對上述問題，本研究擬選取乳腺癌組織樣本及乳腺癌細胞系MCF-7為研究對象，觀察miR-335靶向生存素對乳腺癌細胞系MCF-7增殖的調控作用，旨在為乳腺癌細胞的分子靶向治療提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料2015年7～12月30例女性乳腺癌組織及癌旁正常組織，由江西省婦幼保健院提供，均為手術切除的新鮮樣本，術前告知患者并簽訂知情同意書，研究經江西省婦幼保健院倫理委員會批準。30例患者中，年齡27～65歲，平均(52.4±6.5)；WHO分級：1+2級 4例，3級 26例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ期21例。Her-2陰性24例，陽性6例；ER陰性11例，陽性19例；PR陰性14例，陽性16例；復發21例，未復發9例。

1.2材料乳腺癌細胞系MCF-7，購于美國ATCC細胞庫；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質粒提取試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、反轉錄試劑盒、miR-335模擬物(miR-335 mimic)、模擬物陰性對照(NC)、survivin 3′-UTR質粒，購于美國Invitrogen公司；Dual luciferase assays，購于美國Promega公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、鏈霉素、青霉素，購于美國Sigma公司；一抗survivin、β-actin，購于大連Santa Cruz公司；ECL化學發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒，購于碧云天生物試劑有限公司；miR-335、U6引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細胞培養常規復蘇乳腺癌細胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養液重懸浮細胞，并置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每天換液1次，收集對數生長期細胞，提取細胞總RNA及總蛋白待進行后續實驗。

1.3.2細胞轉染收集對數生長期的乳腺癌細胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養液將細胞密度調節至2×105cell/well，后接種于6孔板中，共9孔，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h；將上述9孔細胞隨機分為3組，每組3孔，即mimic對照組、miR-335 mimic 組及miR-335 mimic+survivin組，根據上述分組不同，利用LipofectamineTM2000轉染miR-335mimic(50 nmol/L)、相應的mimic對照組(50 nmol/L)及survivin表達質粒(50 nmol/L)；轉染后將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h；收集細胞總RNA及總蛋白待進行后續實驗。

1.3.3雙熒光素酶報告基因檢測分別構建含有野生型survivin 3′-UTR序列的熒光素酶報告基因質粒(survivin-wt)和含有突變型survivin 3′-UTR序列的熒光素酶報告基因質粒(survivin-Mut)。收集對數生長期的乳腺癌細胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養液將細胞密度調節至2×105cell/well，后接種于24孔板中，將survivin-wt質粒與miR-335 mimic或NC共轉染至乳腺癌細胞系MCF-7，將survivin-Mut質粒與miR-335 mimic或NC共轉染至乳腺癌細胞系MCF-7，每組設3個復孔，將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h；采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性，以海腎質粒熒光值作為內參。

1.3.4MTT法檢測細胞增殖收集對數生長期的乳腺癌細胞系MCF-7，按方法1.3.2對細胞進行分組并轉染，轉染結束后每孔加入MTT(5 mg/mL)20μL，37 ℃、5% CO2培養箱繼續4 h；利用MTT法檢測HSC增殖活性，即培養結束后，800 r/min離心10 min，棄上清液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱4 h進行顯色實驗，后吸棄孔內培養上清液，每孔加入100 μL DMSO終止顯色，振蕩10 min，使結晶物充分溶液，采用全自動酶標儀測測A490nm吸光值。

1.3.5Real-time PCR檢測miR-335表達采集經處理后的乳腺癌細胞系MCF-7、乳腺癌組織標本及癌旁組織樣本，參照Trizol試劑盒說明書提取細胞或組織中的總RNA，利用反轉錄試劑盒逆轉錄總RNA至cDNA，取逆轉錄產物加入SYBR Green法行RT-PCR。miR-335以U6為內參，miR-335相對表達量為miR-335與U6拷貝數比值。miR-335序列 (5′-3′)：上游5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC G-3′；下游5′-AGG TAT TCG CAC TGG ATA CGA CA-3′。U6序列 (5′-3′)：上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.3.6Western blot法檢測survivin蛋白表達采集經處理后的乳腺癌細胞系MCF-7、乳腺癌組織標本及癌旁組織樣本，常規提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維膜，5%封閉液4 ℃封閉4 h，后依次加入一抗(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測。

2　結　果

2.1乳腺癌組織、癌旁正常組織中miR-335、survivin表達及相關性RT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比較，乳腺癌組織中miR-335表達顯著降低(P<0.05)，見圖1。 Western blot結果顯示，與癌旁正常組織相比較，乳腺癌組織中survivin蛋白表達顯著增高(P<0.05)，見圖2。Pearson相關性分析結果顯示，乳腺癌組織中miR-335與survivin蛋白表達水平呈負相關(r=-0.327，P=0.014)。

2.2轉染miR-335 mimic對乳腺癌細胞MCF-7中miR-335、survivin表達的影響RT-PCR結果顯示，與轉染mimic對照組相比較，轉染miR-335 mimic可使乳腺癌細胞MCF-7中miR-335表達顯著上調(P<0.05)，見圖3。Western blot結果顯示，與轉染mimic對照組相比較，轉染miR-335 mimic可使乳腺癌細胞MCF-7中survivin表達顯著下調(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與癌旁組織相比較。

圖1乳腺癌組織及癌旁正常組織中miR-335表達

1～5：乳腺癌組織；6～10：癌旁正常組織；A：Western bllot蛋白條帶；B：蛋白定量分析結果；a：P<0.05，與癌旁組織相比較。

圖2乳腺癌組織及癌旁組織中survivin蛋白表達

a：P<0.05，與mimic對照組相比較。

圖3轉染miR-335 mimic對乳腺癌細胞MCF-7中miR-335表達的影響

2.3miR-335對survivin 3′-UTR的靶向作用雙熒光素酶活性檢測結果顯示，共轉染miR-335 mimic與survivin 3′-UTR野生質粒后，乳腺癌細胞MCF-7熒光素酶活性較NC組顯著降低(P<0.05)；共轉染miR-335 mimic與survivin 3′-UTR突變質粒后，乳腺癌細胞MCF-7熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

2.4轉染miR-335 mimic、survivin乳腺癌細胞MCF-7增殖活性的影響MTT法檢測結果顯示，轉染miR-335mimic 24 h、48 h及72 h后，乳腺癌細胞MCF-7增殖活性較轉染mimic對照組顯著降低(P<0.05)；而共轉染miR-335 mimic、survivin后，乳腺癌細胞MCF-7增殖活性較單純轉染miR-335 mimic顯著提高(P<0.05)，但仍顯著低于轉染mimic對照組(P<0.05)，見圖6。

1～5：轉染miR-335 mimic；6～10：轉染mimic對照組；A：Western blot 蛋白條帶；B：蛋白定量分析結果；a：P<0.05，與mimic對照組相比較。

圖4轉染miR-335 mimic對乳腺癌細胞MCF-7中survivin蛋白表達的影響

a：P<0.05，與NC組相比較。

圖5雙熒光素酶報告基因檢測乳腺癌細胞MCF-7中miR-335

a:P<0.05，與mimic對照組相比較；b：P<0.05，與miR-335 mimic組相比較。

圖6轉染miR-335 mimic、survivin對乳腺癌細胞MCF-7增殖活性的影響

3　討　論

既往研究表明，miRNA參與了眾多病理生理過程，尤其是通過發揮類似抑癌或促癌基因的作用，參與惡性腫瘤的發生、發展過程[7]。miR-335已被證實在多種惡性腫瘤中差異表達。但不同惡性腫瘤中miR-335表達趨勢并不相同。王鶴等[8]研究證實，miR-335在非小細胞肺癌組織中呈現高表達狀態，而抑制miR-335表達可起到抑制非小細胞肺癌細胞SPCA-1遷移、侵襲及增殖能力的作用，提示miR-335在非小細胞肺癌中發揮類似促癌基因功能。而王勇等[9]研究發現，miR-335在骨肉瘤組織中呈現低表達，并可通過靶向rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)發揮類似抑癌基因功能。本研究結果顯示，乳腺癌中miR-335表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)；而轉染miR-335 mimic可使乳腺癌細胞MCF-7中miR-335表達上調，并對乳腺癌細胞MCF-7增殖活性起到一定程度的抑制作用，提示miR-335在乳腺癌的進展過程中發揮著類似抑癌基因的功能[10]。

生存素屬于凋亡抑制蛋白家族成員，是目前已知的活性最強的抗凋亡因子，其在惡性腫瘤的增殖、凋亡過程中發揮至關重要的作用。生存素高表達在食管癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中已得到證實[11-12]。生物信息學基因組預測提示：生存素可能是miRNA-335的靶向基因之一。但miRNA-335是否可通過靶向生存素參與乳腺癌細胞增殖及凋亡過程尚未可知。本研究結果顯示，乳腺癌組織中生存素蛋白表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而轉染miR-335 mimic可使MCF-7中生存素蛋白表達得到顯著抑制，提示乳腺癌中miR-335表達與生存素蛋白表達存在一定相關性，而這種相關性很可能是由miR-335負向調控生存素所致[13]。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，共轉染miR-335 mimic與survivin-WT可使乳腺癌細胞熒光酶活性降低，而共轉染miR-335 mimic與survivin-Mut則對乳腺癌細胞熒光酶活性無影響，提示miR-335可特異性與survivin 3′-UTR結合，進而為miR-335靶向生存素提供有力佐證。MTT法檢測結果證實，單純轉染miR-335可顯著抑制MCF-7增殖，而共轉染miR-335及生存素可實現miR-335對MCF-7增殖抑制作用的部分逆轉，提示miR-335靶向生存素是調控MCF-7增殖活性的重要機制。但值得注意的是，轉染生存素并無法完全逆轉miR-335對MCF-7增殖的抑制，分析其原因可能與miR-335靶基因眾多有關。目前已知的miR-335靶基因包括Sp1、ROCK1、HER3等，而miR-335靶向生存素可能僅是miR-335調控乳腺癌增殖的其中一個機制[14-15]。

綜上所述，miR-335可通過靶向生存素參與乳腺癌細胞增殖過程；此外，miR-335還可能通過靶向其他下游基因參與乳腺癌的發生與發展。

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miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7

Huang Yajuan,Du Feng,Wei Lingli

(DepartmentofGalactophore,JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7.Methods(1)Chose breast cancer tissue and para-carcinoma tissue,and used RT-PCR or Western blot to detect the expression of miR-335 and survivin protein.(2)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected miR-335 mimic and mimic control.The expression of miR-335 and survivin protein were detected by RT-PCR or Western blot.(3)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively co-transfection wild type survivin 3′-UTR(survivin-wt)or mutant type urvivin 3′-UTR(survivin-Mut)and miR-335 mimic or negative control(NC)to breast cancer cells MCF-7.The cell luciferase activity were detected by dual-luciferase report gene experiment.(4)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected mimic control,miR-335 mimic and miR-335 mimic+survivin.The cell proliferation activity of each group were detected by MTT method.Results(1)Compared with para-carcinoma tissue,the miR-335 expression of breast cancer tissue significantly decreased(P<0.05),and the survivin protein expression of breast cancer tissue significantly increased(P<0.05).(2)Compared with transfection mimic control,transfection miR-335 mimic can made the miR-335 expression of MCF-7 increased(P<0.05),and made the survivin protein expression of MCF-7 decreased(P<0.05).(3)Compared with transfection NC,co-transfection miR-335 mimic and survivin-wt can made luciferase activity of MCF-7 significantly decreased(P<0.05),but the luciferase activity of MCF-7 was not significantly changes after co-transfection miR-335 mimic and survivin-Mut (P>0.05).(4)Compared with transfection mimic control,the MCF-7 proliferative activity significantly decreased after transfection miR-335mimic(P<0.05).Compared with transfection miR-335 mimic,the MCF-7 proliferative activity significantly increased after transfection miR-335 mimic+survivin(P<0.05),but still lower than transfection mimic control(P<0.05).ConclusionIn breast cancer tissue,the miR-335 show low expression,and survivin show high expression.miR-335 can target survivin to inhibit the proliferation activity of breast cancer cells MCF-7.

microRNAs;breast neoplasms;cell proliferation;miR-335;survivin

黃雅娟(1979-)，主治醫師，本科，主要從事乳腺癌的綜合治療的研究。

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.003

R737.9

A

1671-8348(2016)27-3753-04

2016-02-17

2016-04-06)