苦瓜總皂苷對Ⅱ型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡因子Fas和FasL表達(dá)的影響*

朱定君　殷旭光　劉紫燕　王麗媛

(1. 鄂東集團(tuán)黃石市黃石中心醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 黃石 435000；2. 湖北理工學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 黃石 435000)

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苦瓜總皂苷對Ⅱ型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡因子Fas和FasL表達(dá)的影響*

朱定君1,2殷旭光1劉紫燕1,2王麗媛1

(1. 鄂東集團(tuán)黃石市黃石中心醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 黃石 435000；2. 湖北理工學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 黃石 435000)

目的探討苦瓜總皂苷對Ⅱ型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的影響。方法60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、Ⅱ型糖尿病組(模型組)及苦瓜總皂苷治療組，每組20只。高脂飲食加一次性鏈脲佐菌素建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，模型建立成功后，治療組大鼠給予苦瓜總皂苷20mg/kg·d灌胃治療，其余兩組給予生理鹽水灌胃參考，分別于治療4周和8周后處死大鼠各半，測定血糖、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及心肌組織中Fas和FasL的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果模型組血糖、LDH以及CK明顯高于正常組(P<0.05)；治療組治療4周后血糖LDH和 CK明顯降低，治療8周后進(jìn)一步降低(P<0.05)，免疫組化、Western Blot及RT-PCR可見；模型組Fas和 FasL蛋白及mRNA明顯高于正常組，苦瓜總皂苷治療4周后表達(dá)明顯下降，治療8周后進(jìn)一步降低 (P<0.05)。 結(jié)論苦瓜總皂苷可通過抑制Ⅱ型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)，進(jìn)而減輕糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，可能對糖尿病早期心臟損害有一定的延緩或治療作用。

苦瓜總皂苷; 糖尿病; Fas; FasL

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)生率也日益增高，有研究顯示，目前我國糖尿病患者超過9500萬，已經(jīng)成為了世界第一糖尿病大國[1]，糖尿病的危害極大，能否有效控制糖尿病對今后我國人民的健康以及國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展至關(guān)重要[2]。目前國內(nèi)外對于糖尿病的治療主要以降糖治療為主，飲食方式為輔，但是對中晚期糖尿病的患者已經(jīng)形成的并發(fā)癥療效并不顯著，特別是已經(jīng)導(dǎo)致心血管功能損害的患者[3]。本文采用苦瓜總皂苷治療糖尿病引起的早期心臟損害大鼠，從凋亡和抗凋亡途徑分析其是否可以阻止或延緩糖尿病心臟損害，也為中草藥應(yīng)用于本病的臨床治療提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　資料與方法

1.1主要試劑與儀器鏈脲霉素STZ、兔抗 Fas以及兔抗 FasL購于美國Santa公司；相應(yīng)辣根酶標(biāo)記的二抗和免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司；大鼠LDH以及CK試劑盒購于南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國invitrogen公司，PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1動物與造模方法清潔級雄性SD大鼠60只，大鼠體重為180～200g，由華中科技大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，大鼠在購買后置于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為正常組、模型組以及苦瓜總皂苷治療組3組，每組20只，正常組在全程均給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，模型組和治療組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，之后一次性注射鏈脲佐菌素60mg/kg大鼠體重，1周后檢測其是否造模成功，造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)三天空腹血糖≥16.8mg/L，造模成功后，治療組大鼠給予苦瓜總皂苷20mg/kg·d灌胃治療，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃參考，分別于治療4周后和8周后處死大鼠，觀察相應(yīng)指標(biāo)變化。

1.2.2大鼠心臟質(zhì)量、體重以及血糖等指標(biāo)的檢測分別于治療4周和8周后處死大鼠各半，大鼠處死前禁食12小時，處死大鼠時先稱量其體重，之后測定其空腹血糖(采用血糖儀測定，血液的收集為斷尾采血法)，血液收集后同時用試劑盒檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)以及肌酸激酶(CK)，檢測儀器為分光光度計，此外在大鼠處死后立即取出心臟，稱取心臟質(zhì)量，并計算心臟和體重比值。

1.2.3免疫組化法測定心肌Fas和FasL的蛋白表達(dá)將心臟組織切成5um左右的薄片，切片經(jīng)常規(guī)處理后給予PBS水溶液沖洗三次，之后微波修復(fù)，滴加0.3% H2O2，冷卻后再用PBS水溶液洗滌三次，之后滴加相應(yīng)一抗、二抗后加入DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察其結(jié)果變化，結(jié)果的判定以棕黃色的深淺和位置判定其表達(dá)的多少，同時評估其病理學(xué)改變。

1.2.4RT-PCR檢測心肌Fas和FasL mRNA表達(dá)心肌組織中Fas和FasL mRNA表達(dá)的檢測采用半定量法，具體步驟為：取30 mg心臟組織提取總RNA，提取總RNA后鑒定RNA純度并定量，調(diào)平，之后取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其余RNA置于低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5分鐘，94 ℃變性60秒，65 ℃退火60秒，72 ℃延伸60秒，共進(jìn)行33個循環(huán)，最后72 ℃延伸5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電影并照相，采用imageJ分析其光度值，以β-actin為參照值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，具體引物序列，見表1。

表1　大鼠心肌細(xì)胞Fas和FasL引物

1.2.5Western Blot檢測大鼠心肌組織中Fas和FasL 蛋白表達(dá)心肌組織中Fas和FasL的蛋白表達(dá)采用Western Blot法，具體方法為：稱取100 mg心臟組織，電子勻漿機(jī)磨碎后低溫高速離心機(jī)離心，提取上清液，上清液提取后定量調(diào)平，每組各取30 mg進(jìn)行凝膠電泳，電泳方法按照文獻(xiàn)進(jìn)行[4]，收集到電泳圖片后用Image J計算各條帶的灰度值，以β-actin為參照值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2　結(jié)果

2.1大鼠造模前后基本生活情況比較正常組大鼠在整個過程中飲食和精神狀態(tài)均良好，造模組和治療組在治療前飲食和精神狀態(tài)均良好，造模成功后模型組以及治療組呈明顯的多飲多食特點(diǎn)，同時表現(xiàn)有明顯的多尿，治療組大鼠在治療四周后相較于模型組飲食明顯降低，但相較于正常組仍高，治療8周后與治療4周后基本一致。

2.2大鼠血糖、體重以及心重指數(shù)與正常組相比，模型組血糖以及體重明顯升高(P<0.05)，心質(zhì)量/體重之比明顯下降(P<0.05)，但心質(zhì)量只是略微升高，苦瓜總皂苷治療4周后，血糖和體重明顯下降(P<0.05)，心質(zhì)量/體重明顯升高(P<0.05)，治療8周后進(jìn)一步改善，見表2。

表2　苦瓜總皂苷對大鼠血糖、體重以及心重指數(shù)的影響±s)

注：與模型組相比，①P<0.05；與正常組相比， ②P<0.05

2.3大鼠心功能指標(biāo)LDH和CK模型組CK和LDH明顯高于正常對照組(P<0.05)，治療4周后均明顯下降(P<0.05)，治療8周后進(jìn)一步降低，見表3。

表3　苦瓜總皂苷對大鼠心功能指標(biāo)LDH和CK表達(dá)的影響±s)

注：與模型組相比 ①P<0.05；與正常組相比 ②P<0.05

2.4心肌組織中Fas和FasL免疫組化病理學(xué)分析，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰；糖尿病組大鼠有一定的心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞略微肥大，但并不明顯；治療組與模型相比，細(xì)胞間隙減小，心肌細(xì)胞基本正常。免疫組化可見，正常組心肌組織中Fas和FasL表達(dá)較少，呈輕度染色；模型組則強(qiáng)烈表達(dá)，呈深棕黃色；治療組治療4周后表達(dá)明顯減少，治療8周后進(jìn)一步減少，見圖1和圖2。

2.5大鼠心肌組織中Fas和FasL mRNA表達(dá)與正常對照組相比，模型組心臟組織中Fas和FasL mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，苦瓜總皂苷治療4周后， Fas和FasL表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，治療8周后進(jìn)一步降低，見圖3和表4。

2.6大鼠心肌組織中Fas和FasL蛋白表達(dá)與正常組相比，模型組心臟中Fas和FasL蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，苦瓜總皂苷治療4周后Fas和FasL表達(dá)明顯降低(P<0.05)，治療8周后均明顯降低。見圖4和表5。

圖1大鼠心肌組織中Fas免疫組化圖

Figure 1Immunohistochemical staining of Fas in myocardium of rats

圖2大鼠心肌組織中FasL免疫組化圖

Figure 2Immunohistochemical staining of FasL in myocardium of rats

圖3　治療4周和治療8周后大鼠Fas和FasL mRNA表達(dá)圖

注：與模型組相比①P<0.05；與正常組相比②P<0.05

圖4治療4周和治療8周后，大鼠Fas和FasL蛋白表達(dá)圖

Figure 4Fas and FasL proteins expression in rats after 4 weeks and 8 weeks of treatment

3　討論

當(dāng)前隨著我國基因工程和生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對糖尿病的研究也逐漸深入[5]。目前的研究認(rèn)為，糖尿病并發(fā)癥特別是糖尿病心肌損害并發(fā)癥是Ⅱ型糖尿病的主要也是最為明顯的并發(fā)癥，也是Ⅱ型糖尿病患者的的主要死因，因此研究和關(guān)注糖尿病心臟損害具有十分重要的意義和價值[6]。而對于糖尿病心肌損害的治療，國內(nèi)外均形成了一系列的理論，其治療手段要求在降低血糖和血脂的基礎(chǔ)上給予一定心肌保護(hù)治療，治療藥物目前在臨床中使用較高的主要有鈣離子拮抗藥和β-受體阻滯藥二大類，但長期使用其副作用較高，中醫(yī)對本病的治療思想為益氣、養(yǎng)陰、化痰、祛瘀法中一種或幾種治法組合治療，雖療程較長，但效果可與西藥相當(dāng)[7]。但不得不承認(rèn)，在我國中藥手段治療面臨國際化藥物推廣時，由于藥理成分復(fù)雜，并不易于國外接受，因此中藥提取物研究是急需且必要的。

表5　治療4周和治療8周后大鼠Fas和FasL蛋白相對表達(dá)

注：與模型組相比①P<0.05；與正常組相比②P<0.05

目前關(guān)于中藥成分治療本病的研究均有大量的文獻(xiàn)報道，包括人參總皂苷、四味地黃乙醇提取物、柚皮苷以及蕎麥花葉總黃酮等[8-11]，同時也取得了良好的療效，苦瓜總皂苷是從苦瓜果實(shí)體中提取的一類皂苷類化合物，其在苦瓜中含量較少，醫(yī)學(xué)價值偏高，目前的研究發(fā)現(xiàn)，其可以提高抗氧化能力，降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血糖[12-13]，但是關(guān)于其對糖尿病心臟損害的研究目前還沒有動物實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，因此本次課題圍繞苦瓜總皂苷開展，從凋亡和抗凋亡途徑分析其治療效果，可為苦瓜總皂苷的開發(fā)提供一定的參考。研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜總皂苷可以明顯降低大鼠的血糖和體重，提高心臟占體重比，同時對心功能指標(biāo)CK和LDH也有明顯的改善作用。

凋亡和抗凋亡一直是心肌損傷的重要途徑之一，目前有很多文獻(xiàn)均報道[14-15]，在糖尿病早期，心肌細(xì)胞中就有明顯的凋亡產(chǎn)生，糖尿病中晚期凋亡會加劇，這種凋亡的增加與心肌病變程度是密切相關(guān)的，凋亡的增多會明顯提高心肌病的發(fā)生率[16]。目前關(guān)于凋亡和抗凋亡相關(guān)因子公認(rèn)的幾個基因主要有Bcl22、Fas、FasL及p53等。其中Fas和FasL與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，F(xiàn)as是腫瘤壞死因子家族中一種主要膜受體的存在，在細(xì)胞凋亡中起著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，主要作用于Fas的天然配體Fasl，當(dāng)與Fasl結(jié)合后，可激活細(xì)胞核中死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 (Fas-assosiated deathdomain，F(xiàn)ADD)，而誘導(dǎo)caspase-3 caspase-7以及caspase-8的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-20]。本次研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜總皂苷可以明顯降低心肌組織中Fas和FasL的表達(dá)，進(jìn)而減緩心肌細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心肌的作用。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果提示，苦瓜總皂苷可通過抑制Ⅱ型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)，進(jìn)而減輕糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，可能對糖尿病早期心臟損害有一定的延緩或治療作用。

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Effect of total saponins from bitter gourd to myocardial apoptosis in type 2 diabetic rats

ZHU Dingjun1,2,YIN Xuguang1,LIU Zhiyan1,2,et al

(1.DepartmentofCardiology,HuangshiCentralHospital,Huangshi435000,Hubei,China; 2.SchoolofBasicMedical,HubeiPolytechnicUniversity,Huangshi435000,Hubei,China)

ObjectiveTo investigate the effect of total saponins from bitter gourd to Fas and FasL inl heart of type 2 diabetic rat. Methods60 male SD rats were randomly divided into the normal control group, type 2 diabetes and total saponins from bitter treatment groups. Every group included 20 rats. High-fat diet for one months and streptozotocin established the type 2 diabetic rat model. The treatment group was given total saponins (20mg/kg/d oral) . The remaining two groups were given water fed. 4 weeks and 8 weeks later, the rats were sacrificed. The glucose, lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and the expression of Fas and FasL was researched. ResultsThe blood glucose, LDH and CK of model group were significantly higher than that of the control group (P<0.05). After 4 weeks of treatment, blood glucose LDH and CK of treatment were significantly lower than that of the model group, (P<0.05), The Fas and FasL protein and mRNA expression of model group were higher than thaf of the intervention group (P<0.05). ConclusionSaponins can improve the expression of Fas and FasL in type 2 diabetic rat, reduce cardiac myocyte apoptosis, delay early heart damage and produces some therapeutic effect.

Total saponins from bitter gourd; Diabetes; Fas; FasL

湖北省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(2014HSS012)

劉紫燕，E-mail：wu70521@126.com

R 587.1

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.006

2016-04-25； 編輯： 王小菊)