ANRIL基因與中國川東北漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死相關性研究*

熊利　張波　柳華　劉偉　張愛民　李健康　季一飛

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院，1.康復科；2.神經內科，四川 南充 637000)

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ANRIL基因與中國川東北漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死相關性研究*

熊利1張波1柳華2劉偉2張愛民1李健康1季一飛2

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院，1.康復科；2.神經內科，四川 南充 637000)

目的探討ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL)基因與中國川東北漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死(Atherosclerotic stroke, ATS)的相關性。方法選擇我國川東北地區漢族人群為研究對象，采用病例-對照研究，以200例ATS患者作為病例組，同期體檢的健康人群205例作為對照組進行研究。對ATS發病常見的環境危險因素和ANRIL基因4個單核甘酸多態性位點(SNP)(rs1537378, rs7865618, rs10757274, rs2383206)進行分析，比較不同基因型與ATS發病風險的相關性，并根據性別和年齡進一步分組，進行亞組分析研究ATS是否具有年齡及性別遺傳特異性。結果超重、血脂異常與ATS顯著相關(P<0.05)；rs1537378多態位點的GG基因型、rs7865618多態位點的AA基因型與男性ATS顯著相關(P<0.05)，rs1537378多態位點的GG基因型與年齡≥45歲人群ATS顯著相關(P<0.05)，均顯著增加其ATS易感性。結論超重、血脂異常是ATS的危險因素；ANRIL基因SNPs與中國川東北漢族人群ATS相關。

缺血性腦卒中；動脈粥樣硬化性腦卒中；ANRIL基因；單核苷酸多態性

腦卒中是世界上第二位最常見的死亡原因和主要的致殘原因[1]。研究表明，卒中相關的年度醫療費用預計將從2012年的716億美金突增到2030年的1831億美金[2]。在中國大陸，首次卒中年發病率為116～219/10萬人，每年新發卒中約為1.5～2 百萬人[3]，而2008年全國第三次居民死因調查發現，腦血管病已躍居為城鄉居民第1位死因[4]。我國每年用于治療腦血管病的總支出近200億元，給國家和眾多家庭造成沉重的經濟負擔[5]，其中缺血性卒中(IS)是卒中的主要類型，占所有卒中的43.7%～78.9%[3]。研究表明遺傳因素在IS發病中起了重要作用[6]。由于80%的IS繼發于大動脈粥樣硬化導致的血管阻塞，因此，動脈粥樣硬化相關易感基因研究成為IS遺傳研究的熱點。

染色體 9p21.3 區域上ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus)基因與動脈粥樣硬化風險相關[7]，該基因4個單核苷酸多態性(SNP)位點(rs1537378, rs7865618, rs10757274, rs2383206)在動脈粥樣硬化疾病中研究較多，因此，我們以動脈粥樣硬化性腦梗死(ATS)患者為研究對象，采用SNP標記，應用關聯分析方法，探討ANRIL基因與ATS的相關性。旨在從分子水平上探討IS的發生機制和易感因素，為IS的防治提供新的理論依據。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2012年～2013年南充市中心醫院神經內科住院的IS患者200例作為病例組，入選標準為：① 符合世界衛生組織(WHO)的IS診斷標準[8]，首次發病，發病時間在3周內。② 根據韓國修訂版的TOAST分型標準[9]，分型為ATS。③ 均為漢族，年齡19～70歲，且彼此間均無一、二、三級血緣關系。④ 均同意參與研究并簽訂知情同意書。排除標準為：① 有明確原因的繼發性腦梗死的患者；②合并嚴重肝腎功能不全、感染性疾病、惡性腫瘤及其他嚴重疾病的患者。選擇同期體檢的年齡性別匹配的健康人群205例作為對照組。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料采用問卷調查、實驗室檢測等方法對病例組與對照組的一般資料進行收集，內容包括：性別、年齡、身高、體重、體重指數(BMI)、糖尿病、高血壓、吸煙及飲酒，血脂異常等。BMI≥24為超重[10]；糖尿病以1999年WHO糖尿病診斷標準確診[11]；高血壓以1999年WHO高血壓診斷標準確診[12]；平均每日吸煙1支以上，時間大于一年者為有吸煙史，平均每周飲白酒至少一次，時間大于一年者為有飲酒史[13]，血脂異常以2007年中國成人血脂異常防治指南標準確診[14]。

1.2.2血液DNA提取取每個受試者外周靜脈血2ml，枸櫞酸鈉抗凝，-80℃的冰箱貯存。使用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood，DP318-02/03，北京TIANGEN)按說明操作。

1.2.3SNPs分型本實驗采用上海天昊生物科技有限公司的imLDR多重SNP分型平臺對所有樣本進行SNP位點分型。操作步驟簡介如下：① DNA樣本取1μl, 1% agarose電泳對樣本進行質量檢查以及濃度估計，然后根據估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μl。② 多重PCR反應： PCR反應體系(10 μl)為：1x GC-I buffer(Takara.)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA和1 μl多重PCR引物(PCR 引物序列，見表1)。PCR循環程序為：第一步95℃ 2分鐘；第二步是11個循環，依次是：94℃ 20秒，65℃40秒(在該步驟中每個循環每次降低0.5℃)，72℃ 1分鐘30秒；第三步是24個循環，分別是：94℃20秒，59℃30秒，72℃1分30秒；第四步72℃2分鐘，最后保持在4℃。

表1　PCR引物序列

注：F和R分別代表引物的方向(F.正向;R.反向)

③多重PCR產物純化：在10μl PCR產物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1小時, 然后75 ℃滅活15分鐘。④連接反應：連接反應體系為：10x 連接緩沖液 1μl、高溫連接酶 0.25 μl、5′連接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3′連接引物混合液(2 μM)0.4 μl、純化后多重PCR產物 2 μl、ddH2O 6 μl 混勻。連接程序為：首先進行38個循環(94 ℃ 1分鐘，56 ℃ 4分鐘)，最后保持在4 ℃。連接引物及其序列，見表2。⑤測序及分析：取0.5 μl 稀釋后的連接產物，與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9μl Hi-Di 混勻，95 ℃變性5分鐘后上ABI3730XL測序儀。連接產物通過ABI3730XL的毛細管電泳來區分，測序儀上收集的原始數據用GeneMapper4.1 (AppliedBiosystems, USA) 進行分析。

表2　連接引物及其序列

注：每個SNP位點有三條連接引物，兩條鑒別引物和一條通用引物，F和R分別代表引物的方向(F.正向，R.反向)；G、A則表示該條鑒別引物能夠鑒別出的基因，P代表該條引物為通用引物。

2　結果

2.1兩組資料分析病例組共200例，其中男性123例，女性77例，年齡36～72歲，平均(59.12±8.65)歲。對照組共205例，其中男性111例，女性94例，年齡40～70歲，平均(58.67±7.86)歲。兩組在性別、年齡及高血壓病史、糖尿病病史上差異無統計學意義(P>0.05)。超重 (BMI≥24)、血脂異常、吸煙史、飲酒史的比例差異在兩組間有統計學意義 (P<0.05)。多元logistic 回歸分析顯示，經調整協變量后，兩組僅超重 (BMI≥24)、血脂異常的差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　兩組研究對象的臨床資料比較

注：P′值和OR′(95%CI)′值為調整各環境因素的影響后，多元Logistic回歸分析結果；兩組比較①P<0.05。

2.2單個SNP關聯分析病例組和對照組中SNP 多態位點基因型進行Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗，結果顯示，所有SNP位點基因型頻率分布均符合HWE (P>0.05)，表明我們所選取的樣本來自同一群體，具有人群代表性適合做遺傳學分析。

2.2.1總樣本人群中SNPs和ATS的關系在總體樣本的所有遺傳模式下，病例組與對照組中rs2383206、rs10757274等2個SNPs位點的等位基因頻率及基因型頻率差異均無統計學意義(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，2個SNP多態位點(rs1537378， rs7865618)均與ATS發病顯著相關(P<0.05),調整協變量后，這種相關性仍然具有統計學意義，見表4-1。

2.2.2亞組分析兩組研究對象均分別根據性別和年齡分成亞組，對不同組別的亞組間進行分析。在年齡(<45和≥45 歲) 亞組中，由于年齡 <45 歲組中僅有10名ATS患者及32名對照人員，因此，僅對≥45 歲年齡組進行分析。

2.2.2.1男性亞組分析男性亞組中4個SNPS位點基因型和等位基因頻率分布分析結果顯示，所有遺傳模式下，ATS組與對照組中rs2383206、rs10757274等2個SNPs位點的等位基因頻率及基因型頻率差異均無統計學意義(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，rs1537378多態位點的GG基因型(P=0.004)和等位基因A(P=0.004)與ATS顯著相關；rs7865618多態位點的AA基因型(P=0.013)和等位基因G(P=0.014)與ATS顯著相關。調整協變量后，rs1537378位點的GG基因型和rs7865618位點的AA基因型仍與ATS顯著相關，見表4-2。

表4-1　4個SNPS位點在總樣本人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P<0.05

表4-2　4個SNPS位點在男性人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P<0.05

2.2.2.2女性亞組分析在女性亞組的所有遺傳模式下，單變量分析和多元回歸分析均顯示ATS組與對照組中4個SNPs位點的等位基因頻率及基因型頻率均沒有顯著差異(P>0.05)。

2.2.2.3年齡≥45歲亞組分析在所有遺傳模式下，ATS組與對照組中rs2383206、rs10757274等2個SNPs位點的等位基因頻率及基因型頻率均沒有顯著差異(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，在調整協變量前后，rs1537378多態位點和rs7865618多態位點都與ATS顯著相關(P<0.05)，見表4-3。

3　討論

動脈粥樣硬化是心腦血管系統疾病的主要病理基礎，斑塊破裂及繼發血栓形成可導致多種急性腦血管疾病的發生。IS大多繼發于大動脈粥樣硬化導致的血管阻塞，抗動脈粥樣硬化是防治IS的重要手段之一。IS是由遺傳因素和環境因素相互作用或分別作用于不同環節而引起的一種復雜疾病，其與冠心病具有共同風險因子和病理生理學機制，環境危險因素只能解釋大約50%的發病風險，遺傳因素在IS發病中也具有十分重要的作用[6]，研究動脈粥樣硬化相關易感基因，已成為IS遺傳研究的熱點之一。研究顯示，染色體9p21區域是與多種動脈粥樣硬化性心腦血管疾病相關的易感位點[15- 19]，包含多種基因簇參與細胞周期調控、增殖分化及調亡等多種重要生理過程[20]，該區域的遺傳變異是廣大學者最為關注的焦點之一。ANRIL是其基因簇的一員，并參與調控該基因簇的表達[19, 21]。已有研究證實，ANRIL與多種心腦血管疾病有關[22- 25]。通過對ANRIL基因與ATS相關性的研究，從遺傳因素角度并結合環境因素進一步闡述ATS的發病機制，為ATS的防治提供理論基礎，具有重要意義。

表4-3　4個SNPS位點在45歲以上人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P< 0.05

3.1ATS的環境危險因素本研究對ATS患者常見的環境危險因素進行了統計分析，發現超重、血脂異常增加了ATS發病風險。ATS被認為是與血脂異常最為相關的卒中亞型[26]，高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)是動脈粥樣硬化的保護性因素，具有改善血管內皮功能、抗血栓、促纖溶等作用[27]，越來越多的研究證實，HDL- C偏低是IS的危險因素之一[28]。BMI是反應人體是否肥胖的重要指標，超重或肥胖是高血壓、糖尿病、血脂異常等多種代謝性疾病的危險因素[29, 30]，有報道顯示30.6%的腦卒中由肥胖引起，肥胖可作為腦卒中的預測指標之一，能增加腦卒中的發生風險[31, 32]。

3.2SNP與ATS相關性總體樣本人群的單位點分析結果顯示，在等位基因及顯性遺傳模式下，rs1537378及rs7865618等2個SNP多態位點基因型在病例組和對照組人群中的分布均有顯著性差異(P<0.05)，表明此2個多態位點基因型是我國漢族人群ATS的易感位點。調整各環境因素的影響后，rs1537378多態位點的GG基因型、rs7865618多態位點的AA基因型均與ATS顯著相關，是ATS的危險等位基因，可增加ATS的易感性，也間接證實了9p21染色體區域遺傳與ATS的關聯性。

按照性別和年齡不同做進一步的亞組分析，結果顯示在男性亞組中， rs1537378多態位點的GG基因型、rs7865618多態位點的AA基因型與ATS顯著相關，增加了ATS發病風險。在女性亞組的所有遺傳模式下，4個SNPs位點的等位基因頻率及基因型頻率在病例組和對照組中均未見明顯差異(P>0.05)。在年齡≥45歲亞組中，可見rs1537378多態位點的GG基因型與ATS顯著相關(P<0.05)，是ATS發病的風險基因型。提示rs1537378多態位點的GG基因型、rs7865618多態位點的AA基因型可增加男性ATS的易感性，使ATS的發生風險分別增加了3.124倍和2.973倍；rs1537378多態位點的GG基因型與年齡≥45歲人群ATS顯著相關，ATS發生風險分別增加了2.191倍。

綜上所述，本研究首次揭示了ANRIL基因與中國漢族人群ATS的相關性，從遺傳學角度在基因水平上探討了ATS的易感因素，為ATS發生機制和防治的研究提供了新的理論基礎。但本研究病例來源均為我國四川地區的漢族人群，且樣本量較少，為闡明ANRIL基因在ATS中的確切作用，并避免因樣本量少所造成的偏倚，尚需進一步擴大樣本納入范圍，在其他地區和種族人群中進行進一步深入研究，并增加更多相關指標的檢測與統計分析，并對研究對象進行隨訪，以了解正常人群后期該病的發病情況以及病例人群的病程、進展及預后與該基因的關系。

4　結論

本文資料顯示，在川東北漢族人群中，體質量超重、血脂異常是ATS的危險因素；并提示ANRIL基因SNPs與ATS有臨床相關性。

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ANRIL genetic variation is associated with atherothrombotic stroke in Chinese Han population in Northeast Sichuan

XIONG Li, ZHANG Bo, LIU Wei, et al.

(1.DepartmentofRehabilitation,TheSecondClinicalMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China; 2.DepartmentofNeurology,TheSecondClinicalMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveThis study aims were to evaluate whether the single nucleotide polymorphisms (SNP) of the ANRIL gene were associated with increased risk of atherosclerosis stroke (ATS) in Chinese Han population in Northeast Sichuan. Methods200 patients with ATS of Chinese Han population in Nanchong region (Northeast Sichuan) included as case group and 205 healthy people as control group. The genotyping of 4 SNPs in ANRIL gene were tested and analyzed, as well as the association of SNPs with ATS were compared. Subgroup analyses were also carried out to determine whether the effect of the ANRIL polymorphism is specific to age and gender in participants. ResultsDyslipidemia and overweight were significantly associated with ATS (P<0.05). GG genotype of rs1537378 and AA genotype of rs7865618 were significantly associated with ATS in male subgroup (P<0.05), while GG genotype of rs1537378 was significantly associated with ATS in ≥45 year’s old subgroup (P<0.05), which could increase ATS susceptibility. ConclusionsDyslipidemia and overweight are risk factor for ATS. SNPs of ANRIL genes are associated with ATS in Han nationality of Chinese population.

Ischemic stroke; Atherothrombotic stroke; ANRIL gene; Single nucleotides polymorphism

四川省科技廳資助項目(2012JY0043)；四川省教育廳重點項目資助(12ZA049)

柳華，博士，E-mail:hxliumedidoctor@163.com

R 543.5

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.005

2016-01-04； 編輯： 陳舟貴)