PD-1在骨髓增生異常綜合征中的表達及意義*

蒙珊　趙萬紅　張亦琳　王芳俠　田村秀人　山下泰史

(1.西安交通大學第二附屬醫院血液內科， 陜西 西安 710004；2.日本醫科大學附屬病院血液內科， 日本 東京 113-860)

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PD-1在骨髓增生異常綜合征中的表達及意義*

蒙珊1趙萬紅1張亦琳1王芳俠1田村秀人2山下泰史2

(1.西安交通大學第二附屬醫院血液內科， 陜西 西安 710004；2.日本醫科大學附屬病院血液內科， 日本 東京 113-860)

目的檢測負性共刺激分子PD-1在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中的表達，分析其表達水平與相關臨床指標之間的關系，探討其在MDS發病過程中所起的作用。方法收集44例MDS患者外周血標本(MDS組)和25例健康者外周血作陰性對照(NC組)，采用流式細胞術檢測PD-1在T細胞上的表達， RT-PCR檢測T細胞亞群中PD-1 mRNA的表達，同時ELISA法檢測MDS患者血清中可溶性PD-1的水平。收集MDS患者相關臨床指標，線性相關分析法分析PD-1mRNA水平與各項臨床指標之間的關系。結果MDS組患者中PD-1mRNA表達陽性率為(11.31±0.18)%，而NC組陽性率為(6.46±0.25)%，與NC組相比，MDS患者中CD3+、CD4+及 CD8+ T 細胞上PD-1表達水平及PD-1 mRNA水平顯著升高。MDS組患者血清sPD-1水平較NC組明顯升高。在MDS組患者中，CD3+、CD8+ T細胞上PD-1的表達水平與LDH水平呈顯著正相關，CD4+T細胞上的表達水平與CRP呈顯著正相關。 結論 T細胞表面PD-1分子的高表達可能在MDS發病過程中起到一定作用。

PD-1；骨髓增生異常綜合征(MDS)；T細胞；LDH；CRP

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是一種造血干細胞異常克隆所致的血液系統惡性疾病，目前國內外公認的觀點認為，自身免疫因素在其發病中起了重要作用[1,2]。該觀點認為由于多種免疫負調控機制的參與，使患者自身免疫細胞不能有效清除異常克隆，從而導致本病的發生[3]。

近年來，PD-1(programmed death-1)/B7-H1信號通路作為重要的免疫負調控通路，由于其在多種自身免疫病及惡性腫瘤的免疫耐受中的作用而備受關注[4]。PD-1分子屬于免疫球蛋白超家族的一員，在T、B淋巴細胞抗原受體激活后呈誘導性的表達于T、B細胞表面。PD-1有兩個屬于B7家族的配體，分別為B7-H1(又稱為PD-L1或CD274)和B7-DC(也稱PD-L2或CD273)。PD-1與B7-H1結合后，與T細胞受體共同傳遞抑制性信號給T細胞，抑制T細胞增殖、活化和細胞因子的分泌，從而誘導T細胞的凋亡[5]。

目前多項研究證實，PD-1與B7-H1的相互作用在多種血液系統疾病如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、再生障礙性貧血中起著重要作用[6]，但關于MDS患者中PD-1/B7-H1通路的研究較少，該通路在MDS發生發展中的作用仍不明確[7]。因此，本研究擬通過檢測MDS患者體內PD-1的表達水平，分析其表達水平與相關臨床指標之間的關系，以探討PD-1在MDS發生發展中可能的作用。

1　材料與方法

1.1材料FITC標記的抗PD-1單抗及PE標記的抗CD8單抗購自eBioscience公司，PE標記的抗CD3、抗CD4單抗購自美國BD公司；FACScan雙色流式細胞儀(美國BD公司)；SuperscriptⅡ反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；SYBR Priemix Ex TaqTM試劑盒購自TAKARA公司；CD3免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司；ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2方法

1.2.1標本收集收集2007～2009年日本醫科大學附屬病院血液內科收治的44例MDS患者(MDS組)，其診斷及分型符合WHO標準[8]，患者一般臨床資料(見表1)。獲得相關知情同意后，收集上述患者的肝素抗凝外周血及其血清(-80℃保存)用于下一步實驗。另選25例健康者(NC組)的外周血作陰性對照(negative control, NC)。同時收集患者的相關臨床指標，包括血紅蛋白、血小板、LDH、C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)等指標。

表1　44例MDS患者一般臨床資料

1.2.2流式細胞術檢測MDS患者及健康者外周血T細胞上PD-1的表達每個流式檢測管中分別加入50 μl稀釋好的FITC標記的抗PD-1單抗及PE標記的抗CD3單抗(或抗CD4、抗CD8的單抗)，同型對照管中加入50 μl緩沖液，隨后每管分別加入100 μl全血輕輕混勻后，避光孵育15～30 min，每管分別加入2 ml紅細胞裂解液，混勻后室溫避光孵育10 min，室溫300 g離心5 min，棄上清后緩沖液洗滌細胞2次，重懸后上機檢測，采用儀器自帶的Cellquest software 軟件進行數據分析。

1.2.3RT-PCR檢測MDS患者及健康者外周血T細胞上PD-1mRNA的表達水平取5例健康者及2例MDS患者的外周血，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs)，采用免疫磁珠分選法分離CD3+T細胞，純度達98%以上。健康者的CD3+T細胞使用植物血凝素刺激2 d(終濃度為10 μg/ml)后作為陽性對照。提取CD3+T細胞的總RNA，使用SuperscriptⅡ 反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，隨后采用SYBR Priemix Ex TaqTM試劑盒進行基因擴增，擴增引物為PD-1上游：CGCACGAGGGACAATAGGAG，PD-1下游：GGTCTTCTCTCGCCACTGGAA，內參基因ACTB引物上游:TGGCACCCAGCACAATGAA，下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA。PD-1 mRNA表達水平使用ABI PRISM 7500快速實時熒光定量PCR系統進行分析，2-ΔΔCt法分析PD-1mRNA的相對含量。每個實驗重復3次。

1.2.4ELISA法檢測MDS及其健康者血清中可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD-1)的水平取出-80℃保存的血清，室溫融化，取出4 ℃保存的試劑盒，室溫平衡后按照試劑盒說明書進行操作，隨后采用酶標儀測定各孔在450 nm處的OD值。參照試劑盒說明書計算各樣本sPD-1的濃度。

1.3統計學分析應用SPSS 17.0軟件及GraphPad Prism5.0對數據進行統計分析。各變量數值采用均值±標準差進行表示，兩組之間連續變量的比較采用Student’st檢驗，采用線性相關分析法分析PD-1水平與各項臨床指標之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PD-1在MDS患者T細胞上的表達水平流式細胞術檢測結果表明，PD-1在MDS患者CD3+T細胞、CD4+T、CD8+T細胞上的表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，兩組PD-1表達水平，見表2。

表2　兩組病例PD-1 在T細胞上的表達

注:與NC組相比①P<0.05

2.2PD-1mRNA在MDS患者CD3+T細胞中的表達水平顯著升高從5例健康者及2例MDS患者血標本中分離出了高純度的CD3+T細胞，并對CD3+T細胞上PD-1的表達水平進行了定量研究。結果顯示，1例MDS患者的PD-1mRNA表達水平明顯高于陽性對照組，另外1例MDS患者PD-1mRNA表達水平與NC組中最高者的表達水平相似，見圖1。

圖1PD-1mRNA在CD3+T細胞上的相對表達量

Figure 1Expression of D-1 mRNA in CD3+ T cells

注：PC. 陽性對照細胞(PHA刺激后的健康者CD3+T細胞); NC. 陰性對照(健康者); P. MDS患者

2.3MDS患者血清sPD-1的表達水平明顯升高對20例MDS患者及11例健康者的血清，采用ELISA法檢測了血清中sPD-1的水平。結果顯示，MDS組患者血清中sPD-1水平較NC組明顯升高(P<0.05)，見圖2。

2.4PD-1高表達與LDH、CRP水平密切相關采用線性相關分析法對PD-1的表達水平與各項臨床指標之間的關系進行了分析。結果顯示，在MDS組患者中，PD-1在CD3+、CD8+T細胞上的表達水平與LDH水平呈顯著正相關(見圖3)，在CD4+T細胞上的表達水平與CRP呈顯著正相關(見圖4)。同時發現PD-1表達水平與血小板水平趨勢一致，但兩者之間無明顯相關性(P>0.05，見圖5)，未發現PD-1表達水平與血紅蛋白之間存在相關性。

圖2兩組病例血清sPD-1水平比較

Figure 2 Serum sPD-1

3　討論

PD-1為近年來新發現的負性共刺激分子之一，通過與其配體B7-H1相結合，在T細胞免疫應答的初始階段及效應階段抑制T細胞的活化、促進T細胞凋亡，從而介導免疫耐受。MDS為惡性克隆性疾病，目前已有研究表明，MDS患者體內細胞免疫功能低下，T細胞數量明顯降低，CD8+T細胞、NK細胞數量減少、功能受抑[9]。因此我們推測PD-1/B7-H1信號通路可能在MDS的發病中起著一定作用。

本課題組前期采用MDS細胞系及患者標本進行的相關研究發現，MDS原始細胞表面B7-H1表達水平較健康者明顯增高，細胞的侵襲能力增強，抑制T細胞增殖、誘導T細胞凋亡的能力越強，且其表達水平與MDS患者疾病危險度密切相關。體外實驗發現，這些B7-H1能與正常T細胞上表達的PD-1相結合，從而誘導T細胞的凋亡[10]。由此推測，T細胞表面可能存在PD-1的過度表達，其接受B7-H1介導的負性共刺激信號后， T細胞增殖受抑制、凋亡過度，從而導致MDS的發生。

圖3T細胞上PD-1表達與LDH水平之間的相關性

Figure 3Relationship of expression of PD-1 and LDH in T cell

注：NS.無顯著性差異

圖4T細胞上PD-1表達與CRP水平之間的相關性

Figure 4Relationship of expression of PD-1 and CRP in T cell

注：NS.無顯著性差異

圖5T細胞上PD-1表達與血小板水平之間的相關性

Figure5Relationship of expression of PD-1 and platelet

注：NS.無顯著性差異

本研究進一步證實，MDS患者T細胞通常存在PD-1的過度表達，其表達陽性率和mRNA表達水平均明顯高于健康者，且在不同T細胞亞群中的表達水平具有一定的差異性。其可能原因是在負性免疫調節的過程中，不同的T細胞亞群起著不同的作用[11]。另外我們還發現，PD-1mRNA表達水平與患者血漿LDH及CRP水平呈顯著正相關，與血小板水平趨勢一致，但無統計學意義；而與血紅蛋白水平無明顯相關性。

LDH是一種常用的腫瘤標志酶，其活性水平很大程度上可以反映惡性細胞的增殖、代謝等生物學性狀[12]。而CRP作為一種炎癥蛋白，已被證實與多種惡性疾病的預后相關[13]。由此推測，PD-1表達水平也與MDS患者的預后相關，其表達水平越高，與B7-H1結合后傳遞的負性免疫調控作用越強，抑制T細胞增殖、促進T細胞凋亡的作用越強，預后越差。國內學者曾慧等研究認為，MDS患者PD-1表達水平升高的同時，伴隨著其他一些負性信號，從而共同起到抑制T細胞活化的作用；另外他們還發現，PD-1表達水平隨著MDS疾病的進展而升高[14]。本課題組研究結論與該結論一致[15]。

多項研究證實，除了細胞模型之外，PD-1還存在可溶型，即sPD-1。機體內的sPD-1通過血液循環到達靶器官或作用靶點，從而在免疫應答中發揮作用[16]。研究發現腎癌患者血清中sPD-1水平明顯升高，且與患者淋巴結轉移、分期及預后相關[17]。本研究發現，MDS患者sPD-1水平較健康對照組明顯升高，據此推測，MDS患者血清sPD-1水平可能在MDS患者的診斷及預后中具有一定的價值。

隨著對PD-1/B7-H1信號通路在惡性疾病中負性免疫調控作用的逐步揭示，針對PD-1/B7-H1的靶向治療逐漸成為研究熱點[18-19]。目前為止，PD-1/B7-H1通路阻斷劑和抗PD-1和PD-L1 單克隆抗體的研究已在相關領域取得了突破性進展。多項荷瘤動物實驗表明，阻斷PD-1/B7-H1通路可以增強抗腫瘤效應、延長生存期、改善預后。Rosenblatt等[20]使用CT-011阻斷多發性骨髓瘤中的PD-L1通路，取得了良好效果，Hallett等[21]發現在小鼠多發性骨髓瘤模型中，聯合造血干細胞移植及PD-1/B7-H1阻斷治療，可使荷瘤小鼠存活率提高至40%。且在上述實驗中并未觀察到明顯毒性和致死性不良反應。目前，多種針對PD-1/B7-H1通路阻斷的單克隆抗體用于進展期惡性腫瘤的臨床試驗都在進行中[22-23]。因為該通路在MDS發病中可能起著類似的作用，由此推測，在不久的將來，該療法可能也將為MDS的治療提供新的思路。

4　結論

本文資料提示，PD-1在MDS患者T細胞上呈高表達，其表達水平與患者LDH及CRP水平呈正相關。研究結果為進一步揭示MDS的臨床發病機制提供了基礎。

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PD-1 expression in myelodysplastic syndromes and its clinical significance

MENG Shan1, ZHAO Wanhong1, ZHANG Yilin1,et al

(1.DepartmentofHematology,TheSecondHospitalAffiliatedMedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,Shanxi; 2.DivisionofHematology,DepartmentofMedicine,NipponMedicalSchool,Tokyo113-8603,Japan)

ObjectiveTo examine PD-1 expression in myelodysplastic syndromes (MDS) patients, analyze its correlation with some selected clinical parameters and explore its role in MDS pathophysiology. MethodsBlood specimens from 44 MDS patients were collected, and specimens from 25 healthy volunteers were used as negative control (NC). Flow cytometry assay and RT-PCR were used to detect PD-1 expression on T cells and PD-1 mRNA expression in different T cell subsets, respectively, and ELISA was applied to detect soluble PD-1 (sPD-1) in MDS patients serum. Then linear correlation analysis was performed to analyze the relationship between PD-1mRNA level and selected clinical parameters. ResultThe expression rate of PD-1 of MDS patients and NC were 11.31±0.18% and 6.46±0.25%. Compared with NC, MDS patients had high expression of PD-1 and PD-1mRNA in T cell subset including CD3+, CD4+ and CD8+T cells. sPD-1 in MDS patients was significantly high than that in NC group. In MDS patients, PD-1mRNA levels in CD3+ and CD8+T cells had positive correlation with LDH levels, whereas it mRNA level on CD4+T cells showed a positive correlation with CRP level. ConclusionPD-1 overexpresses on T cells of MDS patients, which may play some role in the genesis of MDS.

PD-1; Myelodysplastic Syndromes; T cells; LDH; CRP

陜西省自然科學基礎研究重點項目(2013JZ011)

趙萬紅, 醫學博士,E-mail: 13991365406@163.com.

R 551.3

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.004

2016-06-01； 編輯： 陳舟貴)