蓽拔酰胺通過調控PI3K/Akt信號通路促進胃癌BGC-823細胞p53表達的實驗研究*

溫桂海　王濤　朱濤

(1.邯鄲市中心醫院普外一科，河北 邯鄲 056001; 2.四川大學華西醫院，四川 成都 610041)

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蓽拔酰胺通過調控PI3K/Akt信號通路促進胃癌BGC-823細胞p53表達的實驗研究*

溫桂海1王濤1朱濤2

(1.邯鄲市中心醫院普外一科，河北 邯鄲 056001; 2.四川大學華西醫院，四川 成都 610041)

目的研究蓽拔酰胺對胃癌BGC-823細胞的抑制作用和對p53表達的調節作用及相關的分子機制。方法采用不同濃度的蓽拔酰胺(0μM、2μM和20μM)對胃癌BGC-823細胞進行干預。在不同時間點(0h、24h和48h)采用MTT法對BGC-823細胞活性進行檢測。干預48h后，采用qPCR對蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞p53 mRNA表達水平進行檢測。采用western blot對蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞p53蛋白表達水平以及PI3K和Akt活化水平進行檢測。結果采用不同濃度蓽拔酰胺(0μM、2μM和20μM)對胃癌BGC-823細胞進行干預后，細胞活性呈時間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。蓽拔酰胺干預48h后，胃癌BGC-823細胞p53 mRNA和蛋白的表達水平呈濃度依賴性增加而PI3K和Akt活化水平呈濃度依賴性降低，差異均存在統計學意義(P<0.05)。結論研究結果表明，蓽拔酰胺可以通過下調PI3K/Akt信號通路的活化水平對胃癌BGC-823細胞的增殖產生顯著抑制作用，并發現該機制與促進抑癌基因p53的表達密切相關。

蓽拔酰胺； 胃癌； BGC-823細胞； p53； PI3K； Akt

【Objective】To explore the anti-cancer property of piperlongumine (PL) in gastric cancer BGC-823 cells and its underlying molecular mechanism. MethodsThree specific concentrations (0μM, 2μM and 20μM) of PL were included in current study. At different time points (0h, 24h and 48h), the cell viabilities of gastric cancer BGC-823 cells were calculated by MTT assay. Meanwhile, the mRNA expression of p53 was measured by qPCR. Then, Western blot was performed to analyze the protein expression of p53 and the phosphorylation of PI3K and Akt. ResultsGastric cancer BGC-823 cells viabilities were dosage-dependently and time-dependently inhibited by PL. Meanwhile, after 48 hours of administrations, our data figured out that p53 expression was dosage-dependently up-regulated and the phosphorylation of PI3K and Akt were dosage-dependently reduced by PL in gastric cancer BGC-823 cells. ConclusionThe anti-tumor property of piperlongumine (PL) very likely results from up-regulation of p53 through the inactivation of PI3K/Akt signal pathway in gastric cancer BGC-823 cells, provides the promising of the clinic use of piperlongumine in the treatment of gastric cancer and other malignant tumors in future.

流行病學調查顯示，近年來胃癌(gastric cancer)的發病率雖有所降低，但其仍然是人類最常見的惡性腫瘤之一，目前仍位居全球惡性腫瘤發病率的第4位和腫瘤死亡人數的第2位[1-4]。國際癌癥研究機構(international agency for research on cancer, IARC) 2008年的調查發現胃癌的發病有明顯的地域性，其中東亞地區的韓國(62.2/10萬人)、蒙古共和國(48.2/10萬人)、日本(46.8/10萬人)和中國(41.3/10萬人)是胃癌發病率最高的區域[1-4]。臨床研究顯示胃癌的病理類型以腺癌(adenocarcinomas)更為常見[1-4]。蓽拔酰胺(piperlongumine, PL)是胡椒科植物蓽茇(Piper longum Linn.)、長柄胡椒(P. sylvaticum Roxb)和瘤突胡椒(P. tuberculatum Jacq.)等的有效藥理成分，其主要在植物的根部含量較高[5-7]。目前多個研究發現蓽拔酰胺具有抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞增殖和分化等多種藥理作用[5-7]。同時在對非小細胞肺癌和白血病細胞的研究中證實蓽拔酰胺的抗腫瘤活性與調控PI3K/Akt信號通路密切相關[8, 9]。本文研究蓽拔酰胺對胃癌BGC-823細胞的抑制作用和對p53表達的調節作用及相關的分子機制。

1　材料和方法

1.1主要試劑和材料PCR試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；MTT試劑盒購買于美國Promega公司；鼠抗人p53抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；小牛血清購買于美國Bovogen公司；蓽拔酰胺購買于美國Sigma公司；RPMI-1640培養基購買于美國Gibco公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養胃癌BGC-823細胞常規接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞活性檢測取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔接種100 μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16h至24h，使細胞同步化。加入不同濃度(0μM、2μM和20μM)的蓽拔酰胺，在37℃，5% CO2條件下培養細胞，未干預組作為對照組。使用MTT比色試驗對不同時間點(0h、24h和48h)的細胞生長狀態進行測定，實驗重復4次。對應時間點的細胞活性(%) = (OD干預組/OD對照組) ×100 (%)[10]。

1.2.3細胞GLUT1 mRNA表達檢測按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qPCR反應。p53正義 5′- GAGGGATG TTTGGGA GATGTAA-3′，反義5′- CCCTGGTTA GTACGG TGAAGTG-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAGG AGCAATGATCT-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-△△CT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[11]。

1.2.4Western blot法檢測細胞p53蛋白表達水平以及PI3K和Akt磷酸化水平按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人p53抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描[12]。

1.3統計學分析采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，計量資料以均數±標準差表示。兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MTT法結果分析在不同濃度(0μM、2μM和20μM)蓽拔酰胺(PL)干預后，采用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)胃癌BGC-823細胞活性進行檢測。與對照組細胞相比較，蓽拔酰胺干預的胃癌BGC-823細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Figure 1Cell viabilities of gastric cancer BGC-823 cells at different time points

藥物濃度不同時間點0h24h48h0μM100%100%100%2μM99.07±4.1371.88±13.06①51.29±7.16①20μM101.11±3.8942.32±9.24①②30.05±4.52①②

注：對應時間點與0μM相比較①P<0.05，對應時間點與2μM相比較②P<0.05。

2.2p53 mRNA和蛋白的表達給予胃癌BGC-823細胞不同濃度(0μM、2μM和20μM)蓽拔酰胺(PL)干預48h后，采用qPCR和western blot法對BGC-823細胞p53 mRNA和蛋白的表達進行檢測。與對照組細胞相比較，給予蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞p53 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖1。

Table 2The mRNA and protein expression levels of p53 and the phosphorylation of PI3K and Akt in gastric cancer BGC-823 cells

藥物濃度p53mRNAp53蛋白PI3K磷酸化水平Akt磷酸化水平0μM10.25±0.050.96±0.020.98±0.032μM7.22±2.13① 0.48±0.15①0.61±0.21① 0.56±0.18①20μM18.89±6.17①②0.94±0.09①②0.37±0.04①②0.41±0.09①②

注：與0μM相比較①P<0.05，②與2μM相比較P<0.05

圖1胃癌BGC-823細胞p53蛋白表達的western blot結果

Figure 1Western blot result of the protein expression of p53 in gastric cancer BGC-823 cells

2.3PI3K磷酸化水平給予胃癌BGC-823細胞不同濃度(0μM、2μM和20μM)蓽拔酰胺(PL)干預48h后，采用western blot法對BGC-823細胞PI3K磷酸化水平(phospho-PI3K/PI3K)進行檢測。與對照組細胞相比較，蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞PI3K磷酸化水平呈劑量依賴性下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2和表2。

圖2胃癌BGC-823細胞PI3K磷酸化的western blot結果

Figure 2Western blot result of the phosphorylation of PI3K in gastric cancer BGC-823 cells

2.4Akt磷酸化水平給予胃癌BGC-823細胞不同濃度(0μM、2μM和20μM)蓽拔酰胺(PL)干預48h后，采用western blot法對BGC-823細胞Akt磷酸化水平(phospho-Akt/Akt)進行檢測。與對照組細胞相比較，蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞PI3K磷酸化水平呈劑量依賴性下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表2。

圖3胃癌BGC-823細胞Akt磷酸化的western blot結果

Figure 3Western blot result of the phosphorylation of Akt in gastric cancer BGC-823 cells

3　討論

胃癌(gastric cancer)作為消化系統最常見的惡性腫瘤之一，在我國具有高發病率、高致死率和低治愈率的特征[1～4]。臨床和基礎研究均證實幽門螺旋桿菌感染(Helicobacter pylori infection)是最為重要的胃癌發生的危險因素[2,13-14]。研究認為有幽門螺旋桿菌感染與65%～80%的胃癌(即全球約660000例)發生密切相關[2,13-14]。同時研究還發現使用抗菌素有效治療幽門螺旋桿菌感染可以顯著降低胃癌的發病率[2,13-14]。進一步研究顯示幽門螺旋桿菌感染可以誘導胃組織淺層的炎癥反應和上皮細胞表型的改變[2,13-14]。同時流行病學調查揭示吸煙、種族、飲食習慣和經濟狀況以及地理環境等均與胃癌的發生有相關性[2,13-14]。由于胃癌較高的發病率和較低的生存率(大部分5年生存率均在20%左右)，尋求新的治療方式和方法將具有重要的價值和意義[2,13-14]。

中草藥蓽茇主要用于腹瀉、嘔吐和消化不良的臨床治療。蓽拔酰胺(piperlongumine, PL)是中藥胡椒科植物蓽茇(Piper longum Linn.)、長柄胡椒(P. sylvaticum Roxb)和瘤突胡椒(P. tuberculatum Jacq.)等的有效藥理成分[5-9]。近期的研究表明蓽拔酰胺具有抑制血小板凝集、抗細菌和真菌以及蠕蟲、鎮痛、抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞增殖、分化、浸潤和轉移等多種生物學活性[15-18]。Sun LD等的研究發現蓽拔酰胺及其衍生物對LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞表達的NO、PGE2、iNOS以及COX-2等炎癥分子均有顯著的抑制作用[15]。同時Son DJ等的研究發現蓽拔酰胺對于小鼠冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成有顯著的抑制作用[16]。Jin HO等的研究顯示蓽拔酰胺可以有效的抑制乳腺癌細胞的增殖[17]。Liu QR等的實驗揭示蓽拔酰胺對膠質母細胞瘤LN229細胞和U87MG細胞的增殖和侵襲有顯著的抑制作用[18]。在本研究中我們的數據顯示與對照組未干預細胞相比較，蓽拔酰胺干預的胃癌BGC-823細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。該結果表明蓽拔酰胺對胃癌BGC-823細胞的增殖有顯著的抑制作用。

目前大量的研究證實PI3K/Akt信號通路的過度活化在包括非小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和肝癌等惡性腫瘤細胞的增殖、分化、浸潤以及血管生成過程均扮演著重要的角色[19-21]。Bonelli MA等的研究顯示PI3K抑制劑NVP-BKM120和NVP-BYL719均可有效的抑制肺鱗狀細胞癌細胞上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)過程及腫瘤細胞體外和體內增殖過程[19]。Ying J等對胃癌患者病理組織分析后發現PI3K和磷酸化AKT的表達水平與患者腫瘤的神經和血管浸潤、腫瘤的大小以及淋巴結轉移及其他組織器官轉移等與腫瘤分期和惡性程度相關的指標間具有正相關性[20]。Tian F等的實驗也證實防己諾林堿可以通過下調PI3K/Akt信號通路的活化水平有效抑制胃癌SGC7901細胞的增殖過程[21]。另一方面近期的研究顯示蓽拔酰胺的生物活性與下調PI3K/Akt信號通路的活化密切相關[8-9]。Wang F等通過在體和離體實驗顯示蓽拔酰胺對于非小細胞肺癌A549細胞的抑制作用與下調PI3K/Akt信號通路的活化密切相關[8]。在本實驗中我們發現與對照組未干預細胞相比較，蓽拔酰胺干預的胃癌BGC-823細胞PI3K和Akt磷酸化水平呈劑量依賴性下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)。該結果表明蓽拔酰胺可以有效下調胃癌BGC-823細胞PI3K/Akt信號通路的活化。

此外由于PI3K/Akt信號通路對于重要抑癌基因p53的表達具有關鍵調控作用[22-23]。本實驗中我們對p53的表達進行檢測后發現與對照組未干預細胞相比較，給予蓽拔酰胺干預的BGC-823細胞p53 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。該結果表明蓽拔酰胺對于胃癌BGC-823細胞p53的合成有促進作用。

4　結論

本研究表明，蓽拔酰胺可以通過下調PI3K/Akt信號通路對胃癌BGC-823細胞的增殖產生顯著抑制作用，并發現該機制與促進抑癌基因p53的表達密切相關。

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Piperlongumine promotes p53 expression via inactivation of PI3K/Akt signal pathway in gastric cancer BGC-823 cells

WEN Guihai1, WANG Tao1, ZHU Tao2

(1.DepartmentofTheFirstGeneralSurgery,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China; 2.WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610000,China)

Piperlongumine; Gastric cancer; BGC-823 cells; p53; PI3K; Akt

中國博士后科研基金(2014M552369)

R 735.2

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.003

2015-10-08； 編輯： 陳舟貴)