結核感染者外周血單個核細胞NLRP3的表達研究*

張燕　周琳　唱凱　陳敏　鄧少麗　陳鳴

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科， 重慶 400042)

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結核感染者外周血單個核細胞NLRP3的表達研究*

張燕周琳唱凱陳敏鄧少麗陳鳴

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科， 重慶 400042)

目的檢測NLRP3 mRNA在潛伏期、活動期結核患者及健康者中的表達差異，探討NLRP3在結核感染中的作用。方法選取10例活動期結核患者(活動期結核組)，20例潛伏期結核患者(潛伏期結核組)，20例健康體檢者(正常對照組)作為研究對象，利用反轉錄PCR方法檢測各組研究對象外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA的表達水平，并比較各組間的差異。結果活動期結核組NLRP3 mRNA表達量是正常對照組的3.71倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；潛伏期結核組NLRP3 mRNA表達量是正常對照組的1.60倍，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論NLRP3可能參與了結核活動期的炎癥反應過程，為進一步研究其在抗結核感染中的作用打下了基礎。

結核病； 外周血單個核細胞； NLRP3

結核病是由結核分枝桿菌感染所致的疾病，是全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一，而我國是結核病最嚴重的國家之一，結核病的控制一直以來備受關注。巨噬細胞是人體固有免疫應答中針對結核分枝桿菌最重要的細胞類型，巨噬細胞表面或胞漿內的模式識別受體通過識別細菌的病原相關分子模式(PAMPs)和內源性危險信號(DAMPs)發(fā)揮殺菌效應。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體[1-2](NLRs)是胞漿內重要的模式識別受體，能感知胞內病原微生物產物及代謝性應激，進而啟動炎癥復合體的組裝。NLRP3作為NLRs 家族中的一員，它主要表達于單核細胞、巨噬細胞等，NLRP3蛋白分子與ASC分子，pro-Caspase-1及PAMP或DAMP共同構成了NLRP3炎癥小體[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)：白色念珠菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒等均能通過NLRP3活化Caspase-1，進而在炎癥反應和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[6-9]。那么，在機體的抗結核免疫反應中，NLRP3是否會參與其中，本研究通過檢測結核感染者與健康者外周血單個核細胞中 NLRP3 mRNA 的表達水平并比較其差異，探討NLRP3在機體抗結核免疫反應中的作用。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2014年7月～2015年5月到本院就診的疑似結核患者，根據(jù)中華醫(yī)學會結核病分會制定的肺結核診斷和治療指南的診斷標準[10]，研究對象入組情況如下：活動期結核組10例，其中男性4例， 女性6例，平均年齡(53.42±13.27)歲；潛伏期結核組20例，其中男性12例，女性8例，平均年齡(53.26±11.56)歲。選取同期到本院進行體檢的健康體檢者20例為正常對照組，其中男性9例，女性11例， 平均年齡(53.67±17.88)歲。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑CFX-96實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，Veriti定性PCR儀(美國ABI公司)，ND-1000微量核酸蛋白測定儀(上海在途生物科技公司)， Ficoll人淋巴細胞分離液和RPMI-1640培養(yǎng)基(天津市灝洋生物制品科技公司)，Trizol(美國Invitrogen 公司)，RT-PCR 試劑盒(美國Promega公司)，引物(北京三博遠志生物公司)，DEPC水(北京索萊寶科技公司)。

1.2.2試驗方法①分離外周血單個核細胞與提取RNA，抽取研究對象新鮮肝素抗凝血5 mL，與5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，加至5 mL Ficoll人淋巴細胞分離液表面，2000 rpm/min 離心22 min，用吸管分離出單個核細胞，并用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌，1800 rpm/min離心7 min，棄上清，單個核細胞留于管底。再加Trizol溶液破裂細胞，利用氯仿、異丙醇、75%乙醇萃取、沉淀的原理提取RNA，并用DEPC水溶解RNA，將提好的RNA通過ND-1000微量核酸蛋白測定儀測定其濃度與純度。②RNA逆轉錄為cDNA，按照RT-PCR反應盒的說明書配置逆轉錄體系PCR混合液，所提取的樣品RNA點樣2 μL，37℃孵育60 min得到cDNA。-20℃?zhèn)溆谩＂蹮晒舛縋CR檢測，將②步驟所得的cDNA進行熒光定量PCR反應，引物設計如下：NLRP3上游引物5′-CGTGACTCCCATTAAGATCGAGT-3′，NLRP3下游引物5′-CCCGACAGTGGATATAGAACAGA-3′，內參GAPDH上游引物 5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，內參GAPDH下游引物5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。擴增反應條件：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，40個循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR反應的結果，計算出活動期結核組、潛伏期結核組和正常對照組中各標本NLRP3和GAPDH的CT值及差值(△ct=CTNLRP3-CTGAPDH)，并計算活動期結核組、潛伏期結核組的△△ct(活動期結核組/潛伏期結核組△ct-正常對照組△ct)，利用2-△△ct計算活動期結核組、潛伏期結核組和正常對照組之間NLRP3 mRNA的表達水平差異。

2　結果

實驗共提取RNA樣本50個，吸光度260/280均在1.8～2.0之間，提示總RNA質量較好。NLRP3和GAPDH溶解曲線如圖1、圖2所示，圖中僅見單峰，提示兩者特異性良好。

圖1NLRP3的溶解曲線

Figure 1The melt curve of NLRP3

圖2GAPDH溶解曲線

Figure 2The melt curve of GAPDH

正常對照組、潛伏期結核組及活動期結核組NLRP3和GAPDH基因的△ct值均呈正態(tài)分布。活動期結核組NLRP3相對于GAPDH的平均△ct 值為(2.83±2.90)；潛伏期結核組NLRP3相對于GAPDH的平均△ct 值為(4.04±1.09)；正常對照組NLRP3相對于GAPDH的平均△ct 值為(4.72±1.29)。活動期結核組、潛伏期結核組與對照組之間的平均△ct值的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。利用相對定量2-△△ct法計算出活動期結核組NLRP3 mRNA表達量是正常對照組的3.71倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；潛伏期結核組NLRP3 mRNA表達量是正常對照組的1.60倍，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　三組患者NLRP3 mRNA相對定量表達差異

注：與正常對照組比較，①P<0.05與潛伏期結核組比較,②P<0.05

3　討論

NLRP3炎癥小體是目前研究得最多的一種炎癥小體，它不僅能被許多細菌、病毒等病原體所激活，同時也能被體內自身產生的危險信號激活[11-13]。NLRP3作為NLRPs蛋白家族中的一個典型代表，在無激活物質存在時，其LRR 結構域與NACHT 結構域結合，抑制自身的寡聚化而處于無活性狀態(tài)。當NLRP3識別的配體直接或間接地結合于LRR時，蛋白質構象發(fā)生改變，PYD 與CARD 結構域暴露出來，PYD 與ASC 的PYD 結合，同時ASC 的CARD 結構域通過CARD-CARD 嗜同作用招募caspase-1 前體對其進行寡聚化，即完成了炎性體的裝配[14-15]。NLRP3炎性體中的caspase-1能將胞內IL-1β的前體在116位天冬氨酸裂解，形成活化的成熟IL-1β分泌到胞外產生各種免疫反應[16-17]。

有研究證明，在小鼠肺結核模型中，NLRP3基因敲除的小鼠肺部IL-1β產生明顯減少，研究還證明巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活依賴結核分枝桿菌的ESX-1分泌系統(tǒng)[18]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌ESX-1系統(tǒng)的分泌產物ESAT-6可以激活NLRP3炎癥小體誘導細胞的死亡，且ESAT-6缺失的變異體不能活化NLRP3炎癥小體引起細胞的死亡[19]。Welin[20]等研究發(fā)現(xiàn)只有用高感染復數(shù)的H37Rv型結核分枝桿菌感染人巨噬細胞，IL-1β的表達及細胞的死亡才會明顯增加。用Caspase-1及組織蛋白酶B的抑制劑不能抑制細胞的死亡，提示表達ESAT-6的結核分枝桿菌活化NLRP3炎癥小體引起細胞的死亡，不依賴Caspase-1及組織蛋白酶B，即非凋亡的死亡。

本研究采用熒光定量的方法檢測了50例研究對象的外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA的表達量，旨在探討其在結核感染中可能的作用。研究結果表明，活動期結核患者NLRP3的表達量較潛伏期結核患者和正常對照人群明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示NLRP3參與了結核感染炎癥反應。而潛伏期結核患者與正常對照人群之間NLRP3的表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。出現(xiàn)這種結果，分析有以下幾方面原因：①研究中收集的病例數(shù)太少，可能存在一定的抽樣偏倚。②潛伏期結核患者體內炎癥反應輕微，不足以引起NLRP3炎癥小體的顯著改變。③NLRP3炎癥小體的表達除受結核的影響外，尚有多種已知或未知疾病可以影響，難以完全排除。

總之，由結核分枝桿菌誘導的細胞死亡與NLRP3有關，因為巨噬細胞的壞死是病理反應的中心過程，因此，針對NLRP3的靶向阻斷可能是有效的治療途徑。但阻斷NLRP3炎癥小體的缺點在于會同時阻斷其對結核分枝桿菌感染的抵抗作用。因此，進一步確認NLRP3在調節(jié)細胞壞死中起關鍵作用，且與其他炎癥活動無關的NLRP3調節(jié)組分將是下一步研究的方向。

4　結論

NLRP3在活動期結核組的表達顯著高于潛伏期結核組和正常對照組，而潛伏期結核組與正常對照組之間無明顯差異，提示NLRP3可能參與了結核活動期的炎癥反應過程，也為進一步研究其在抗結核中的作用提供了臨床資料。

[1]Tschopp J, Martinon F, Burns K. NALPs: a novel protein family involved in inflammation[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003,4(2): 95-104.

[2]Wong KW, Jacobs WR, Jr. Critical role for NLRP3 in necrotic death triggered by Mycobacterium tuberculosis[J]. Cell Microbiol, 2011, 13(9): 1371-1384.

[3]Jin C,Flavell RA. Molecular mechanism of NLRP3 inflammasomeactivation [J]. J Clin Immunol, 2010, 30(5): 628-631.

[4]Martinon F, Burns K, Tschopp J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta[J]. Mol Cell, 2002, 10(2): 417-426.

[5]Pelegrin PA. Surprenant. Pannexin-1 mediates large pore formationand interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor [J].EMBO J, 2006, 25(21): 5071-5082.

[6]童玉娜,何婭妮. NALP3 炎性體與非感染性炎癥疾病[J]. 生理科學進展,2011, 42(4): 317-320.

[7]Cassel SL, Joly S, Sutterwala FS. The NLRP3 inflammasome: a sensor of immune danger signals[J]. Semin Immunol, 2009, 21(4): 194-208.

[8]McGonagle D.Successful treatment of resistant pseudogout with anakinra Arthritis Rheum[J], 2008,58(5):631-633.

[9]Larsen CM.etal.Interleukin-1-receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus[J].Med, 2007,356(2):1517-1526.

[10] 中華醫(yī)學會結核病學分會．肺結核診斷和治療指南[J]．中華結核和呼吸雜志，2001，24(2)：70-74．

[11] Zhou R. A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation[J]. Nature, 2011, 469(7329): 221-225.[12] Abdul-Sater A, Sad-Sadier N, Padilla E,etal. Chlamydial infection of monocytes stimulates IL-1 secretion through activation of the NLRP3 inflammasome[J].Microbes Infect,2010,12(1): 652-661.

[13] Kurenuma T, Kawamura I, Hara H,etal. The RD1 locus in the Mycobacterium tuberculosis genome contributes to activation of caspase-1 via induction of potassium ion efflux in infected macrophages[J]. Infect Immun,2009,77(2): 3992-4001.

[14] 原孟, 尚麗新.NLRP1 和NLRP3 炎性體的研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2013,7(23):10894-10897.

[16] Osborn O.Treatment with an interleukin-1-beta antibody improves glycemic control in diet-induced obesity[J].Cytokine, 2008,44(2):141-148.

[17] Hornung V, Latz E. Critical functions of priming and lysosomal damage for NLRP3 activation[J]. Eur J immunol,2010,40(1): 620-623.

[18] Dorhoi A, Nouailles G, hagens K,etal. Activation of the NLRP3 inflammasome by Mycobacterium tuberculosis is uncoupled from susceptibility to active tuberculosis[J].Eur J Immunol,2012,42(2):374-384.

[19] Mishra BB, Moura-Alves P, Sonawane A,etal. Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome[J].Cell Microbiol,2010,12(8):1046-1063.

[20] Welin A. Human macrophages infected with a high burden of ESAT-6- expressing M. tuberculosis undergo caspase-1-and cathepsin B-independent necrosis[J]. PLoS One, 2011,6(5):20302.

The expression level of the NLRP3 in periphery blood monocyte from tuberculous patients

ZHANG Yan,ZHOU Lin,CHEN Min, et al

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,TheThirdAffiliatedHospitalofTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

ObjectiveTo study the expression level of the NLRP3 mRNA in periphery blood monocyte from tuberculous patients, recessive tuberculous patients and normal people, then explore the effect of NLRP3 in tuberculous patients. MethodsBlood samples were respectively collected from 10 tuberculous patients, 20 cases of recessive tuberculous patients and 20 cases of healthy people. The expression level of the NLRP3 mRNA was detected with real time PCR. ResultsThe expression of NLRP3 mRNA in tuberculous patients was significantly higher than in healthy people and recessive tuberculous patients(P<0.05). There is no difference between healthy people and recessive tuberculous patients(P=0.680，P>0.05). ConclusionNLRP3 may be play an important role in the process of tuberculosis inflammation. This work provides new ideas for the laboratory diagnosis of tuberculosis and new clues for further exploring the pathogenesis mechanism of tuberculosis.

Tuberculosis; Periphery blood monocyte; NLRP3

國家自然科學基金(81401751)

唱凱，E-mail:changaki0203@163.com

R 521

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.031

2016-03-05； 編輯： 王小菊)