FPA與ELISA方法在我國部分地區牛布魯菌病診斷應用中的比較研究

任燕斌, 張　慧,孫翔翔，李澤欽 , 蔡家利, 范偉興

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FPA與ELISA方法在我國部分地區牛布魯菌病診斷應用中的比較研究

任燕斌1，2, 張慧2,孫翔翔2，李澤欽3, 蔡家利1, 范偉興2

目的評價熒光偏振試驗(FPA)在我國部分地區臨床牛血清樣品檢測中的應用。方法熒光偏振試驗(FPA)檢測1 286份牛血清樣本，其中布病感染陽性血清309份，陰性血清977份，ROC曲線分析FPA臨界值；熒光偏振試驗(FPA)、間接ELISA(IELISA)及競爭ELISA(CELISA)同時檢測1 160份牛血清樣本，其中布病感染陽性血清231份，陰性血清929份，Kappa分析檢測方法一致性。結果ROC曲線分析FPA最優臨界值(cutoff)為95 mP，此時敏感性為100%，特異性為99.6%；比較FPA、IELISA、CELISA 3種方法，敏感性分別為97%、99.56%和98.27%，特異性分別為100%、98.06%和99.56%，同時3種方法一致性均≥0.75。結論FPA檢測技術可以用于動物布病診斷，在田間條件下，快速、準確診斷布病，避免動物二次抓捕，適于推廣應用。

布魯菌??；FPA；IELISA；CELISA

動物布病常規血清學診斷方法包括凝集試驗、補體結合試驗以及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。目前我國國標采用RBT初篩，SAT定性的檢測方法。RBT是凝集試驗的一種，敏感性高，但特異性低，只能作為初篩試驗，易受到試驗溫度、凝集時間和人為主觀因素的影響；SAT檢測的主要是IgM抗體，容易受到動物體內其它交叉反應細菌產生的IgM抗體的干擾，敏感性和特異性不高[1-3]，且國外只用于羊血清的檢測；補體結合試驗(CFT)特異性高，但操作步驟繁瑣、耗時；IELISA、CELISA是世界動物衛生組織(OIE)標準規定的布病檢測國際貿易指定試驗方法。其中IELISA[4]為篩選方法，其優勢在于高敏感性，高通量，一般適用于初篩試驗；CELISA采用牛種布魯菌OPS表位之一的特異性單抗作為競爭抗體，其特異性高于IELISA[16]，能有效避免交叉反應，同樣有高通量的特點，一般作為確診方法。但上述兩種方法實驗操作需要特殊的設備及具有一定專業知識的人員分析解釋試驗結果，且無法滿足田間試驗需求。

FPA是世界動物衛生組織(OIE)標準規定的布病檢測國際貿易指定試驗方法之一[5]，其原理基于溶液中分子的隨機運動，通過測定分子的轉動率檢測抗體的存在。Nielsen等將布魯菌OPS片段(22 kD)作為抗原標記異硫氰酸熒光素，檢測布病感染牛血清，具有較高的敏感性和特異性，首次在布病上成功建立FPA方法[6]。與上述傳統診斷方法相比，實驗操作簡單、省時，擁有便攜式儀器設備，適合田間操作，該方法已在多個國家廣泛應用[7-10]。本文用FPA對1 286份牛血清樣本進行檢測，確定FPA陰陽性臨界值；比較熒光偏振試驗(FPA)、間接ELISA(IELISA)及競爭ELISA(CELISA)的敏感性及特異性，分析檢測方法的一致性，為FPA在我國動物布病診斷中的應用積累臨床應用數據。

1　材料與方法

1.1血清樣本牛血清樣本1 286份用于FPA臨界值的分析，其中陽性血清309份，陰性血清977份。牛血清樣本1 160份，其中陽性血清231份，陰性血清929份，用于檢測方法敏感性、特異性的比較及一致性分析。陽性血清來源于本實驗室分離到布魯菌的牛，陰性血清來源于連續3年無布魯菌病檢出的牛場。

1.2試劑布魯菌熒光偏振測定法抗體檢測試劑盒由哈爾濱平河生物技術有限公司提供，IELISA試劑盒為IDEXX生產的Brucellosis Antibody Test Kit；CELISA試劑盒為英國AHVLA生產的COMPELISA 160&400試劑盒。

1.3儀器德國生產FLUPO熒光偏振檢測儀、Bio-Rad酶標儀。

1.4實驗方法

1.4.1IELISA按照IDEXX Brucellosis Antibody Test Kit說明書進行操作。

1.4.2CELISA按照AHVLA COMPELISA 160&400試劑盒說明書進行操作。

1.4.3熒光偏振試驗以88個樣品為1組，準備88個硼硅玻璃試管，做好標記；吸取1 000 μL樣品稀釋液到玻璃試管中；吸取10 μL樣品血清到試管中，震蕩混勻；將試管放在熒光偏振儀上，按順序讀取緩沖液和樣品血清的初始值，測得Blank int.值；每個試管中加入10 μL標記抗原，震蕩混勻，室溫孵育2～5 min；將試管放在熒光偏振儀上,讀取Sample int.值，最終顯示Sample mp.值。

1.5統計學分析采用MedCalc12.7.0.0進行ROC曲線分析，確定FPA陰陽性臨界值(cutoff value)，這種分析方法根據敏感性和特異性的范圍，能夠更好的決定陰陽性的臨界值。SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，應用χ2檢驗和一致性檢驗，以P< 0.05 為差異有統計學意義，以Kappa≥0.75兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4兩者一致性一般；Kappa<0.4兩者一致性較差。

2　結　果

2.1FPA陰陽性臨界值的確定以金標準陰性為0，陽性為1，MedCalc12.7.0.0軟件對測得的樣品mP值進行ROC曲線分析，95%置信度下，在最適合的敏感性和特異性的范圍內，選擇FPA臨界值(cutoff)為95 mP，此時，其敏感性達到100%、特異性為99.6%。檢測1 286份牛臨床血清樣本結果見圖1，ROC曲線分析結果見圖2。繪圖表明不同的臨界值時的敏感性(Y軸)對特異性(X軸)，從這些數據看，臨界值為95 mP時，敏感性為100%，特異性為99.6%。

縱坐標為臨床樣本數，橫坐標為FPA檢測樣本的mP值區間。圖1　FPA檢測1 286份臨床樣本結果頻率分布圖Fig.1　Results of FPA detected 1 286 clinical samples

圖2　ROC分析Fig.2　Analysis results of ROC curve

2.2FPA、IELISA及CELISA血清檢測結果比較231份陽性血清中，FPA、IELISA及CELISA檢測為陽性的血清數分別為224份、230份、227份；929份陰性血清中，FPA、IELISA及CELISA檢測為陰性的血清數分別為929份、911份、925份，3種方法的敏感性、特異性及約登指數見表1，FPA特異性高于IELISA 及CELISA，3種檢驗方法的約登指數都達到97%以上，表明3種方法都有較好的檢測效果。分析FPA與IELISA、CELISA的一致性，見表2、3。結果顯示FPA與IELISA、CELISA比較均為Kappa≥0.75(P<0.000 1)，一致性較好。

表1FPA、IELISA及CELISA的敏感性、特異性

Tab.1Sensitivity and specificity of FPA, IELISA, CELISA

敏感性(%)Dsn特異性(%)Dsp約登指數(%)YodenFPA97.0010097.00iELISA99.5698.0697.62cELISA98.2799.5697.83

表2FPA與IELISA結果比較

Tab.2Comparing results of FPA and IELISA

FPATotalKappa+-valueiELISA+224242480.936-0912912Total2249361160

表3FPA與CELISA結果比較

Tab.3Comparing results of FPA and CELISA

FPATotalKappa+-valuecELISA+22472310.981-0929929Total2249361160

3　討　論

布魯菌病的準確檢疫和快速診斷是預防和控制布病的關鍵環節，傳統血清學方法存在著弊端導致不同程度的誤診和漏檢。FPA方法簡便、快速、通量大，既可用于個體檢測也適合大規模檢疫[11-12]，且適用于不同的樣品檢測(包括血清、血漿、全血、奶液及組織液)[13-14]。本研究使用背景明確的血清，用FPA檢測，經過ROC統計分析，選擇適合的敏感性和特異性后，首次確定了我國部分地區牛血清FPA試驗的臨界值為95 mP，為動物陰陽結果的判定提供了依據，為FPA在我國的應用提供了數據。

FPA試驗的敏感性達到100%，特異性達到99.6%，這些結果表明FPA作為篩選試驗用于布魯菌病的檢測有較好的應用前景[15]。FPA、IELISA、CELISA 3種方法的比較發現，FPA特異性高于CELISA，且FPA與IELISA、CELISA有較高的一致性(Kappa≥0.75)，且相比于ELISA，FPA省去了洗滌和孵育的時間，簡便快速，是臨床檢測布魯菌抗體的良好選擇[16]。這些實驗結果表明我們可以把FPA檢測技術作為動物布病診斷的方法之一，在田間條件下，作為動物布病的篩選試驗，快速、準確診斷布病，避免動物二次抓捕，適于推廣應用。Gall[17]等人對應用于野牛布魯菌病檢測的幾種方法進行了比較，結果表明FPA和CELISA、IELISA的敏感性和特異性相當，同時證明FPA可以區分S19免疫產生的抗體。

本研究用FPA檢測已知背景的1 286份牛血清樣品敏感性和特異性均較高，但對隨機選取用其它方法檢測后已知背景的1 160份血清樣品檢測的結果進行比較時，FPA的敏感性降為97%，特異性為100%，這些結果表明FPA與其他檢測方法具有差異，但不能表明FPA檢測方法不對，這些不同樣品應該做進一步的檢測，是否為疫苗免疫或其它原因。結果可能由于隨機選取的樣本本身未經過金標準的確認，而導致檢測結果與臨界值判定時結果不一致，同時由于血清檢測樣本量較少，也一定程度上影響了對FPA方法評價的準確性，故有必要針對不同感染率、不同地區、不同樣品繼續檢測，為FPA進一步的應用提供依據。雖然在本研究中，FPA顯現出很高的敏感性和特異性，但并不代表FPA不會出現假陽性和假陰性，而導致漏診和誤診的情況。所以在臨床檢驗時，用敏感性好，操作簡便的檢測方法進行初篩，然后再選用敏感性、特異性均好的檢測方法進行復篩[18]。

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Comparative study of FPA and ELISA method in the diagnosis of animal brucellosis

REN Yan-bin1,2, ZHANG Hui2, SUN Xiang-xiang2, LI Ze-qin3, CAI Jia-li1, FAN Wei-xing3

(1.ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing404100,China；2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266000,China；3.PingheBiotechnologyInstitute,Heilongjiang150000,China)

In order to evaluate the application of fluorescence polarization test (FPA) for clinical detection of serum sample, 1 286 samples of cattle serum which included 309 positive sera and 977 negative serum samples were tested, and then we used the ROC curve to analyse the FPA critical value. The sensitivity and specificity of FPA, IELISA, and CELISA were compared through testing 1 160 samples of cattle and analyzing, and the consistency of these three detection methods were applied by using Kappa analysis. The result of the analysis of ROC curve showed that 95 mP was the optimal threshold for the test of FPA; the diagnostic sensitivity and specificity were 100% and 99.6% respectively; the sensitivity were 97%, 99.56% and 98.27% respectively; the specificity were 100%, 98.06%, and 99.56% for the diagnostic of FPA, IELISA and CELISA respectively. At the same time, consistency of the three methods was all≥0.75. FPA could be used in animal brucellosis diagnosis under field conditions. The rapid and accurate diagnosis of brucellosis could avoid animal twice arrested and suitable for application.

brucellosis; FPA; IELISA; CELISA

Fan Wei-xing, Email: fwxsjl@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.009

范偉興，Email: fwxsjl@126.com

1.重慶理工大學，重慶404100；

2.中國動物衛生與流行病學中心，青島266000；

S852.5

A

1002-2694(2016)09-0806-04

2015-06-08；

2016-05-07

重慶市科技攻關計劃(No.cstc2012gg-yyjs80014)、國家科技計劃項目(No.2012FY111000)和重慶市科技人才培養計劃(No.cstc2013kjc-ljrcpy80001)聯合資助

3.哈爾濱大熊貓診斷技術開發有限公司,哈爾濱150000

Supported by the Chongqing Research Program(No.cstc2012gg-yyjs80014)，the National Science and National Science and Technology Program(No.2012FY111000)and the Chongqing Municipal Science and Technology Talents Scheme(No.

cstc2013kjc-ljrcpy80001)