中哈邊境阿拉山口口岸輸入性貓櫛首蚤指名亞種線粒體COI和COII基因序列分析

羅　丹，王安東，尹小平，田延河,梁　臻,巴　特,張江國

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中哈邊境阿拉山口口岸輸入性貓櫛首蚤指名亞種線粒體COI和COII基因序列分析

羅丹1，王安東2，3，尹小平3，田延河3,梁臻3,巴特3,張江國3

目的分析阿拉山口口岸地區(qū)輸入性貓櫛首蚤指名亞種細(xì)胞色素C氧化酶I(COI)和II(COII)基因特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。方法從2014年1月入境集裝箱死貓體表采集蚤類樣本，形態(tài)學(xué)鑒定完畢后提取DNA，PCR 擴(kuò)增COI和COII基因并測定序列，使用Mega 6.0通過ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果貓櫛首蚤指名亞種COI和COII基因富含A+T，堿基突變多為置換突變，無移碼，缺失和插入突變；Blast顯示與澳大利亞貓櫛首蚤指名亞種同源性較高(99%)。結(jié)論COI基因序列存在足夠的變異能夠區(qū)分親緣關(guān)系很近的種類，為外來或新發(fā)現(xiàn)的蚤種的鑒別提供了分子水平的技術(shù)依據(jù)。

貓櫛首蚤指名亞種;細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 I(COI);細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 II(COII); 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);序列分析;中哈邊境

阿拉山口口岸是中國與哈薩克斯坦的邊境國家一類口岸，包括鐵路口岸，公路口岸，此外還有原油管道運輸,是第二座亞歐大陸橋中國段西部的橋頭堡。阿拉山口口岸2013年全年過貨量達(dá)2 982.9萬噸[1]。近年來我國口岸在入境國際交通工具、集裝箱和貨物中發(fā)現(xiàn)并捕獲大量輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物[2]。2014年，我們從哈薩克斯坦入境集裝箱一死貓體表采集到蚤類樣本，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為貓櫛首蚤指名亞種。本研究使用線粒體COI和COII基因?qū)斎胄载垯笔自橹该麃喎N進(jìn)行基因序列分析，分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為口岸地區(qū)建立外來或新發(fā)現(xiàn)蚤種分子鑒定方法奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1樣本采集2014年從一入境集裝箱死貓體表采集蚤類樣本，置于95%無水乙醇中，以備后續(xù)研究。

1.2形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)陸寶麟蚤的鑒別方法[3]，利用體式顯微鏡對采集的蚤類樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3分子生物學(xué)鑒定

1.3.1DNA提取按照DNeasy○RBlood & Tissue kit(QIAGEN)說明書提取基因組DNA(5只/1組)，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2線粒體COI和COII基因克隆PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及條件參考A. L. Lawrence的報道，引物合成及PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.3序列分析與系統(tǒng)樹構(gòu)建PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)分析比對。 通過Mega 6.0 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹和遺傳距離分析。

表1PCR反應(yīng)引物和擴(kuò)增條件

Tab.1Primers of COI and COII sequences and reaction condition of PCR

目的基因(Gene)引物名稱(Premer)序列(5'-3')(Sequence)片段大小(bp)(Fragment)預(yù)變性(℃,S)(InitialDenaturation)變性(℃,S)(Denaturation)退火(℃,S)(Anneaking)延伸(℃,S)(Extension)循環(huán)數(shù)(Cycle)總延伸(℃,S)(FinalExtension)參考文獻(xiàn)(Reference)COILCO1490GGTCAACAAATCATA-AAGATATTGG60195,6095,1555,1572,103572,300[4]HC02198TAAACTTCAGGGT-GACCAAAAAATCACOIIF-LeuTCTAATATG-GCAGATTAGTGC72795,18094,3042,3072,153772,300R-LysGAGACCAGTACTT-GCTTTCAGTCATC

2　結(jié)　果

2.1蚤采集與鑒定結(jié)果現(xiàn)場在貓體表采集蚤類標(biāo)本75只，隨機選取其中40只進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)體式顯微鏡觀察，所選取標(biāo)本均為貓櫛首蚤指名亞種。

2.2線粒體COI和COII基因擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過PCR擴(kuò)增貓櫛首蚤指名亞種線粒體COI和COII基因，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可得到601 bp和727 bp左右的核酸片段，與預(yù)期片段大小相符。

2.3線粒體COI和COII基因組成分析該貓櫛首蚤指名亞種COⅠ基因片段 A、C、G、T的平均堿基含量分別為31.0%，16.2%,14.9%，37.8%，堿基 A+T含量是68.8%，有4個堿基置換突變位點(3個T-C轉(zhuǎn)換,1個A-G轉(zhuǎn)換)，無移碼，缺失和插入突變；COII基因片段 A、C、G、T的平均堿基含量分別為35.8%; 12.1%; 9.5%; 42.6%,堿基 A+T含量是78.4%，有2個堿基置換突變(1個t-a顛換,1個轉(zhuǎn)換g-a)，無移碼，缺失和插入突變。

2.4Blast分析貓櫛首蚤指名亞種COI基因與Ctenocephalidesfelis(JN008917，澳大利亞)具有99% (621/629)的同源性，與Ctenocephalidesfelisfelis(KP684201，捷克)具有100% (592/592)的同源性；與Ctenocephalidesfelisfelis(KP687808，印度)具有99% (582/587)的同源性；與Ctenocephalidesfelisstrongylus(KF684875，塞舌爾)具有98% (582/592)的同源性，與Ctenocephalidescanis(KP684211，捷克)具有92% (596/647)的同源性，與Ctenocephalidesorientis(KF684867，泰國)具有92% (546/591)的同源性。COII基因顯示與Ctenocephalidesfelisstrongylus(KF684933，塞舌爾)具有99% (704/709)的同源性，與Ctenocephalidesorientis(KF684922，泰國)具有99% (704/709)的同源性；與Ctenocephalidesfelisfelis(KT376424，澳大利亞)具有99% (703/709)的同源性；與Ctenocephalidesfelisfelis(HQ696926，澳大利亞)具有99% (703/709)的同源性，與Ctenocephalidesfelis(JF966771，塞內(nèi)加爾)具有99% (704/710)的同源性。

2．5系統(tǒng)進(jìn)化樹分析分子遺傳進(jìn)化樹顯示：該貓櫛首蚤指名亞種COI基因序列與澳大利亞、捷克、塞舌爾三國貓櫛首蚤指名亞種遺傳距離在0.0052-0.0141之間，與Ctenocephalidesfelis(JN008917，澳大利亞)形成獨立一支，與Ctenocephalidesfelisfelis(KP684201，捷克)形成姐妹支；其COII基因序列與澳大利亞、塞內(nèi)加爾2國貓櫛首蚤指名亞種遺傳距離在0.0029-0.0057之間，其單獨形成一支，與Ctenocephalidesfelisfelis(KT376424，澳大利亞)、Ctenocephalidesfelisstrongylus(KF684933，塞舌爾)和Ctenocephalidesfelisfelis(HQ696926，澳大利亞)形成姐妹支。

圖1　基于COI基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1　Phylogenetic tree of COI gene

表2貓櫛首蚤指名亞種COI基因序列間遺傳距離

Tab.2Estimates of evolutionary divergence between sequences of COI form Ctenocephalides felis felis

12345671:Ctenocephalides_felis_clone_KCF1_2:Ctenocephalides_felis_felis_voucher_AL351-30.0123365713:Ctenocephalides_felis_felis_isolate_R3B0.0141210430.0087735724:Ctenocephalides_felis_strongylus_voucher_AL083-40.0213554260.0159210080.0141123075:Ctenocephalides_canis_voucher_AL348-10.0904615780.0881504550.0925141680.0947793186:Ctenocephalides_orientis_voucher_AL058.10.0972749420.0860444450.0903947570.0926513950.0502881197:Ctenocephalides_felis_felis_ALSK-Z070(COI)0.0070122480.0052446180.0141123070.0213420550.0816089610.088280342

表3貓櫛首蚤指名亞種COII基因序列間遺傳距離

Tab.3Estimates of evolutionary divergence between sequences of COII Ctenocephalides felis felis

1234561:Ctenocephalides_felis_felis_ALSK-Z070(COII)2:Ctenocephalides_felis_strongylus_voucher_AL083-10.0042835703:Ctenocephalides_orientis_voucher_AL056.10.0042835700.0057278284:Ctenocephalides_felis_felis_isolate_RC0010.0028553660.0071750270.0042953635:Ctenocephalides_felis_felis_voucher_JM17.10.0028553660.0071750270.0042953630.0000000006:Ctenocephalides_felis_voucher_Dielmo140.0057178040.0071677920.0014221920.0057335900.005733590

3　討　論

線粒體DNA是1個封閉的環(huán)狀雙鏈，它是由13個編碼蛋白質(zhì)的基因、2個rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)、22個tRNA基因和1個包含復(fù)制起點的控制區(qū)組成的[5-6]。與脊椎動物mtDNA相比,昆蟲mtDNA富含更多A+T,C+G含量偏低[7]。本研究發(fā)現(xiàn)：COI基因堿基A+T含量是68.8%；COII基因堿基A+T含量則高達(dá)78.4%。蚊蟲COI和COII基因序列間顛換頻率高于轉(zhuǎn)換頻率[8-9]，此次研究發(fā)現(xiàn)貓櫛首蚤指名亞種COI基因堿基突變均為轉(zhuǎn)換，而COII基因顛換與轉(zhuǎn)換頻相同，有別于蚊蟲序列間堿基突變頻率。

COI基因由于其氨基酸的演化速率較慢可以區(qū)分時間較遠(yuǎn)的種類，同屬物種的COI基因序列又存在有足夠的變異能夠區(qū)分親緣關(guān)系很近的種類，所以它被廣泛應(yīng)用于不同分類階元層次上的分子系統(tǒng)學(xué)研究[10]。COII基因序列具有很高的趨異性，尤其是一些雙翅目和膜翅目昆蟲,COII基因序列和氨基酸序列均表現(xiàn)出高度的趨異性,眾多研究表明COII基因在雙翅目昆蟲進(jìn)化機制和系統(tǒng)重建研究上是一種有效的分子標(biāo)記[9]。目前運用線粒體COI和COII基因研究昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化的研究越來越多。張映梅等對我國44種重要蚤類進(jìn)行DNA條形碼初步研究,結(jié)果表明，同種個體之間的同源性達(dá)到99%以上，不同種之間的同源性最高僅為90%，且?guī)缀跛性轭惗寄鼙籇NA條形碼正確鑒定(種間序列差異大于2%)，可以進(jìn)行準(zhǔn)確快速鑒定[11]。此次研究發(fā)現(xiàn)：貓櫛首蚤指名亞種COI基因序列與Ctenocephalides felis strongylus(KF684875，塞舌爾)具有98%(582/592)的同源性，與Ctenocephalides orientis(KF684867，泰國)具有92%(546/591)的同源性，而COII基因顯示與Ctenocephalidesfelis strongylus(KF684933,塞舌爾)具有99%(704/709)的同源性，與Ctenocephalides orientis(KF684922,泰國)具有99%(704/709)的同源性。由此可見，COI基因序列存在足夠的變異能夠區(qū)分親緣關(guān)系很近的種類。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展，世界各地的貿(mào)易越來越頻繁，增加了媒介生物入侵的風(fēng)險。此次發(fā)現(xiàn)該從哈薩克斯坦輸入性貓櫛首蚤指名亞種COI和COII基因序列均與澳大利亞貓櫛首蚤指名亞種同源性較高(99%)，由此我們推測，該輸入性貓櫛首蚤指名亞種與國際貿(mào)易往來有密切關(guān)系，進(jìn)一步佐證媒介生物隨交通工具入侵的風(fēng)險。因此在國境口岸地區(qū)建立媒介生物的快速檢測方法顯得尤為重要，本研究為口岸快速準(zhǔn)確地識別宿主和外來醫(yī)學(xué)媒介生物的監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

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COI and COII sequences analysis for an importedSiphonapterasample ofCtenocephalidesfelisfelisat Alataw Pass，China-Kazakhstan

LUO Dan1，WANG An-dong2,3，YIN Xiao-ping3，TIAN Yan-he3,LIANG Zhen3，BA Te3，ZHANG Jiang-guo3

(1.CollegeofMedicine，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China;3.AlashankouEntry-ExitInspectionandQuarantineAuthority，Alashankou833418，China)

To analyze the molecular of cytochrome c oxidase subunit I (COI) and subunit II (COII) of mitochondrial DNA and the phylogenetic relationship ofCtenocephalidesfelisfelisat Alataw Pass，China-Kazakhstan，blood feedingSiphonapterawere collected from cat and DNA was extracted after morphological Identification. The COI and COII gene sequence were amplified. The phylogenetic trees was constructed by Mega 6.0 based on the nucleotide sequences ofSiphonapterapublished in the GenBank and the homology was analyzed. Result showed that the A+T in the amplified COI and COII fragments ofCtenocephalidesfelisfeliswere rich.Ctenocephalidesfelisfeliswere 99% closely related toCtenocephalidesfelisfelisin Australia. It’s suggested that COI nucleotide identification could be used to classify species ofSiphonapteraand provide molecular basis for identifying the foreignSiphonapteraspecies at Alataw Pass or other frontier ports.

Ctenocephalidesfelisfelis; COI; COII; PCR; sequence analysis; China-Kazakhstan

Yin Xiao-ping，Email: yxpciq@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.005

尹小平，Email:yxpciq@163.com

1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子832000；

2.新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832000；

R384.3

A

1002-2694(2016)09-0789-04

2016-02-23；

2016-06-21

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(No.2016LK264)資助

3.新疆阿拉山口檢驗檢疫局，阿拉山口833418

Supported by the AQSIQ Science ang Technology Project (No.2016LK264)