福州市生殖道沙眼衣原體的MLST分子流行病學研究

王惠榕，蕭劍雄

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福州市生殖道沙眼衣原體的MLST分子流行病學研究

王惠榕，蕭劍雄

目的研究多位點序列分型法(MLST)在福州地區性病門診人群生殖道沙眼衣原體基因分型中的分辨力，并與來自阿姆斯特丹性病門診女性患者的樣本進行比較。方法采用MLST分型法研究福州性病門診生殖道沙眼衣原體感染者的基因型，eBURST進行ST型地理分布特征分析。結果從86份陽性標本中可獲得完整MLST數據的樣本為76份，共分30個ST型，其中14個為新的型別。MLST分型法的Simpson分辨力指數為0.9。eBURST分型結果顯示30個ST型分為3個克隆復合體和5個獨特型。僅有4個ST型在福州和阿姆斯特丹兩地同時存在。結論MLST為生殖道沙眼衣原體分子流行病學調查提供高分辨率的分型手段。eBURST 分析可揭示不同地理來源的生殖道沙眼衣原體之間的進化關系。

生殖道沙眼衣原體；多位點序列分型法；分子流行病學

生殖道沙眼衣原體引起的性病迅速上升,在發達國家己超過淋病占據性傳播疾病的首位。據世界衛生組織估計,2008年新發病例達1.057億[1]，近10年來，我國生殖道沙眼衣原體的病例也不斷增多，而大部分的女性和眾多男性均為無癥狀感染者，這些未確診的攜帶者是重要的傳染源，且通常因未被視為一個影響公眾健康的重要問題而被忽視。流行病學研究表明感染的傳播除取決于性伴的選擇方式和感染的相對危險度外，還與特定的社交網絡和橋梁人群有關[2]，這些流行病學資料的獲得大多來源于問卷調查或訪談，被調查者對敏感問題回答的真實性將對抽樣推斷造成偏誤。而分子分型法從基因分析層面研究各菌株之間的克隆關系，確定感染源和感染途徑，為流行病學調查結果提供了新的證據。

生殖道沙眼衣原體OmpA分型法是基于編碼主要外膜蛋白(MOMP)OmpA基因進行分型，用該分型法表明與國外報道相似，我國主要流行基因型以E和F型為主[3-7]。由于E和F型菌株在流行株中占比較大，用OmpA基因分型法無法確定E或F型菌株間是否存在差異。因而，近年來研發的分辨率高的多位點序列分析(MLST)陸續被應用于生殖道沙眼衣原體的流行病學研究中。本研究的目的是將MLST方法應用于福州地區性病門診人群生殖道沙眼衣原體的感染的分型，探討相同OmpA基因型的菌株間存在的差異獲得菌株間潛在的遺傳進化關系。

1　材料與方法

1.1樣本來源2013年8月—2014年10月在福州市皮膚病防治院性病門診就診，臨床疑似生殖道沙眼衣原體感染患者。

1.2標本采集及保存男性患者以男性采樣拭子采集尿道分泌物，女性患者先用無菌棉擦去宮頸口周圍的分泌物幾黏液，再用女性采樣拭子采集宮頸分泌物。標本管中加入1.0 mL雙蒸水，室溫放置10 min后，轉動棉簽在管口擠壓并棄去棉簽，所有的拭子洗脫液均保存在-70 ℃冰箱中。用中山大學達安基因股份有限公司的沙眼衣原體(CT)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)檢測樣本。

1.3方法

1.3.1DNA提取自-70 ℃冰箱中取出凍存的樣本，12 000 r/min離心10 min，細胞沉淀用QIAamp DNA mini kit 試劑盒提取基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2PCR擴增巢式擴增5個區域，分別為：CT046(hctB)、CT058、CT144、CT172和CT682(pbpB)。所用引物參照MLST網站合成[8]，各區擴增長度分別為624～733 bp、600～601 bp、443 bp、358～666 bp和602 bp。第一輪PCR反應體系如下：PCR Premix 25 μL，上下游外引物各5 μL(10 umoL/L)，模板DNA 5 μL，反應體系加滅菌蒸餾水至50 μL。反應條件： 95 ℃預變性15 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環，最后末次延伸72 ℃ 10 min。取5 μLPCR產物作模板,用內引物擴增,進行第2輪擴增，擴增條件同第1輪。兩輪反應均設置水為陰性對照。PCR產物檢測用1×TAE制備1.0%瓊脂糖凝膠，其中含有1.0 μg/mL EB；將水平電泳儀電壓調整為100 V，電泳時間為45 min。

1.3.3測序PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司純化后雙向測序。測序引物為第2輪擴增引物。將雙向測序得到的兩條序列用 Lasergene 7.0 軟件中的 SeqMan 模塊進行切割和拼接。

1.3.4序列分析將拼接、切割后整理好的序列導入MLST網站(http://mlstdb.bmc.uu.se)，得到每個基因位點對應的等位基因編號，依據 5個等位基因編號的組合，基因排列順序為 hctB-CT058-CT144-CT172-pbpB，這一組基因編號稱為等位基因圖譜(Allelic profiles)，每個編號的組合對應一個ST 型，即每一株菌對應唯一一個ST型。利用 DnaSP5.10分析基因多態性。

1.3.5分辨力計算采用辛普森指數作為分辨力計算方法，按以下公式計算[8]。N代表分析的菌株數，j代表等位基因型數目，x代表某一等位基因型的菌株數。

1.3.6eBURST分析用eBURST(Based upon related sequence type)V3.0 軟件分析菌株間的進化關系，將不同ST歸類為克隆復合體(Clonal complex ，CC)、組和獨特型(singleton)。互為單位點變異型( single-locus variant，SLV)的序列型構成組。如果該組有足夠多的ST且其中1個ST 擁有與之相應的最多數量的SLV，那么可將該ST型暫定為起源型ST，而該組被稱為克隆株復合體，不能被歸到任何組的ST 就是獨特型。將本研究中的ST型與來自阿姆斯特丹性病門診的70份樣本的ST型進行比較分析[9]，用eBURST 軟件繪出各ST型之間的關系圖。

2　結　果

2.1檢測陽性率在2 019份疑似標本中，實時熒光定量PCR法檢出沙眼衣原體陽性樣本86份，陽性率為4.26%。患者平均年齡為32.81±1.05歲。

2.2PCR擴增結果5個靶基因全部擴增出的樣本有76份(88.37%)，余下的陽性標本僅能得到部分靶基因。

2.3MLST分型結果76份已知OmpA分型結果的樣本共分為30個ST 型[11]，其中新的ST型有14個，占46.67%，新的ST型用ST1001～ST1014表示。含樣本數量最多的 ST 型為ST-110(21份)；其次分別為 ST-3(9份)、ST-35(5份)、ST-264(5份)、ST-1001(4份)、ST-34(3份)、ST-400(2份)、ST-402(2份)，余型別均僅含1份樣本,占32.89%。見表1。

2.4核苷酸多態性分析在76份樣本中，hctB、CT058、CT144、CT172和 pbpB靶基因片段分別具有5、7、4、5、8種序列。DANsp5.0軟件分析測序所得的5個基因片段的核苷酸多態性，結果以Pi表示。5個靶基因序列的Pi值分別為0.0187 7、0.007 7、0.042 9、0.145 81及0.012 87，CT172具有最大的核苷酸多態性，其次為CT144。CT058基因多樣性少、最穩定，說明CT058 基因在菌株系統進化過程中，變異的速率較低。

表176份樣本的等位基因譜

Tab.1Genetic profiles of all 76 samples

SThctBct058CT144ct172pbpBompAIslolates2111081118B1312622E9201041417D326104148K134108148H3351081417D511012724F21130104135G12111081118B1264104116J5277106136G13811081317D14005197354F2402104118K2404104146J1415472724F187352622E11001106146G410021015146G11003104724F11004472622E110051041117D1100612714F21013126260E11014474116J1100712612E11008104112E1100912114F11010102116J11011472122E1101210491026G1

2.5分辨力分析用ompA分型法76株可分為8個基因型[10]，而MLST分為30個ST型，其分辨力是OmpA分型法的3.75倍。主要流行型F和E型分別被MLST法分為6個和7個ST型。OmpA分型法辛普森指數為0.80，MLST分型法為0.90。

2.6ST型的eBURST分析eBURST(Based upon related sequence type)分析是一種依據相關序列型來進行分群的生物信息學方法，由克隆復合體可以推斷出菌株進化過程中的原始序列型。76份樣本形成3個克隆復合體和5個獨特型，以核心位置的ST編號來命名克隆復合體分別為CC110、CC3和CC264。CC264是以ST-264為核心的復合體，包括 ST-1008、ST-1014、ST-1005、ST-264、ST-1010、ST-402、ST-404、 ST-20、ST-35、ST-381、ST-26、ST-34、ST-1001、ST-277、ST-1002，其中ST-404、ST-20、ST-35、ST-381、ST-26、ST-34、ST-1001、ST-277和ST-1002組成一個亞群。CC 3是以ST-3為核心的復合體，包括ST1011、ST-1004、ST-3、ST-1007、ST-1003、CC 110是以ST-110為核心的復合體，包括 ST-1009、ST-1006、ST-110、ST-415；ST-211、ST-130、ST-1003、ST-1012和ST-400分別是5個獨特型，即僅有一個序列型。軟件預測ST-264是CC264的原始序列型，ST-404是亞群的原始序列型，ST-3是CC3的原始序列型，ST-110是 CC110的原始序列型，見圖1。將本研究的ST型別與來自阿姆斯特丹的ST型別進行eBURST分析，將源自本研究的ST型標注為綠色，源自阿姆斯特丹的ST型標注為黑色，淺紫色為兩地都具有的ST型，見圖2。分析可見，原始序列型為ST-3的CC3克隆復合體包含來自阿姆斯特丹ST-86，同樣原始序列型為ST-264的CC-264克隆復合體包含來自阿姆斯特丹ST-105和ST-92，而本研究中為獨特型的ST-400則被包含于CC12克隆復合體中，其原始序列型則為來源于阿姆斯特丹ST-12，表明不同地理來源的某些菌株親緣關系相近，可能具有共同的進化祖先。僅有ST-87、ST-35、ST-34和ST-20在兩地同時流行。

圖1　沙眼衣原體陽性樣本的eBURST分析結果

Fig.1Clonal grouping ofC.trachomatis-positive samples based on the eBURST analysis

圖2福州與阿姆斯特丹沙眼衣原體分離株的eBURST結果

Fig.2The eBURST analysis ofC.trachomatis-positive samples from Fuzhou Area and the reference samples from Amsterdam Area

3　討　論

傳統的基于管家基因為基礎的MLST分型方法適用于長期的進化研究。由于本研究歷時僅1年左右，因而采用Klint研發的適用于短期臨床流行病學分析的MLST分型法[11]。與傳統方法不同，該方法并非嚴格意義上基于保守基因位點的MLST分型法，而是基于5個可變的基因位點hctB、CT058、CT144、CT172和 pbpB為基礎的分型法。本研究對5個靶基因序列的核苷酸多態性分析表明，5個靶基因序列均存在多樣性，以CT172和CT144基因最不穩定，序列進化速率高。由于5個靶基因的高度可變性，該分型法的穩定性曾遭到質疑。但許多實驗室研究證實了靶基因的相對穩定性，如1960年分離的F型參考株F/IC-cal3的ST型為ST-12,至今該型仍然廣泛流行；新型變異沙眼衣原體經過72代培養在5個靶基因區域未發生變異[11]。

本研究中的ST型將近半數為新發現的ST型，有可能是因為數據庫建立的時間不夠長，數據庫中的數據量不足引起的，但同時也反映了沙眼衣原體存在地區差異。將本研究中的ST型與阿姆斯特丹的ST型進行比較，也發現地區差異的存在，但也發現有個別ST型在兩地同時存在。2015年對MLST數據庫中2 089份樣本415個ST型的分析也發現了這一現象，來自16個國家2 000多份樣本僅有極少數的ST型在多個國家同時存在[12]。一種可能為來自兩地的伴侶通過性活動感染，但考慮到兩地間距離遙遠，似乎這種可能性很小。另一種可能是經過長期的進化，某些沙眼衣原體菌株的基因組相對穩定，這些ST型被認為是起源型。因此，ST-3、ST-12和ST-264有可能是起源型；或是由于某些菌株擁有某種特性如：特殊的組織嗜性或具有免疫逃逸能力而更易于在全世界傳播。

在研究中，我們發現MLST分型法的工作量較大且并非所有real-timePCR篩查陽性的樣本均能擴增出5個靶基因。這是因為篩檢時目標片段為rRNA或隱蔽性質粒，這些均為高拷貝片段，而分型的片段來源于低拷貝的染色體基因組。盡管研究的方法仍存在局限性，但其分辨力辛普森指數較ompA分型法高4倍左右，是一種分辨率高的分型技術。總之，MLST分型作為一種新型的分子分型方法更加適用于臨床關系較近的菌株分型，且通過網絡共享數據庫進行分析，有利于全球范圍的數據標準化。

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High resolution multilocus sequence typing application in molecular epidemiological research ofChlamydiatrachomatisstrains in Fuzhou City

WANG Hui-rong，XIAO Jian-xiong

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention，Fuzhou350001，China)

We assessed the discriminatory ability of high resolution multilocus sequence typing (MLST) which was used as typing method ofChlamydiatrachomatisstrains from the outpatients visiting sexually transmitted infection clinic in Fuzhou City. Sequence types (STs) were compared with strains from women visiting the sexually transmitted infection clinic in Amsterdam. All samples were typed using MLST. The geographical distribution of STs was characterized by eBURST analysis. Full sequence types were obtained in 76 out of 86C.trachomatispositive samples and 30 STs could be identified，of which 14 were novel to the MLST database. The Simpson’s index was found to be 0.90 for MLST. By the eBURST analysis，30 STs were assigned to 3 clonal complexes and 5 singletons. Only 4 STs were identical between Fuzhou City and Amsterdam. MLST provides a high-resolution tool for epidemiological investigations.The eBURST analysis can reveal the evolutionary relationship amongC.trachomatisstrains from different geographic sources.

Chlamydiatrachomatis; multilocus sequence typing; molecular epidemiology

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.008

福建省疾病預防控制中心，福州350001；

Email：fjwhr@hotmail.com

R374

A

1002-2694(2016)09-0802-04

2016-03-29；

2016-07-10