云南臨滄地區蜱種分子生物學鑒定及埃立克體基因序列分析

亞紅祥，張云智，王靜林

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云南臨滄地區蜱種分子生物學鑒定及埃立克體基因序列分析

亞紅祥，張云智，王靜林

目的了解云南臨滄地區蜱蟲種類及其自然感染埃立克體的情況。方法采集耕牛體表寄生的蜱蟲，經形態學鑒定和分組后，從蜱蟲中提取DNA，應用PCR擴增蜱蟲COI基因以及埃立克體16SrRNA和groEL基因，并測序分析。結果共采集到蜱蟲42只，其中微小牛蜱38只占90.48%、血蜱4只占9.52%。將每種蜱的2只為1組，在21組樣本中，檢出COI片斷21份(檢出率100%)；在相同的4組樣本中均檢出埃立克體16SrRNA片斷和groEL片斷4份(檢出率19.05%)?；蛐蛄蟹治?，檢出的COI片斷序列中有2份與澳大利亞pava血蜱(JX573136)的同源性最高(89.3%)，其余19份序列與馬來西亞微小牛蜱B3的同源性最高(99.5%)；檢出的4份16SrRNA片斷序列完全一致，與美國查菲埃立克體Arkansas和埃文埃立克體Aa2FT349及中國北京查菲埃立克體BY-YQ-HME-O18株的同源性均為100%；檢出的4份groEL片斷序列也完全一致，與日本埃立克體Yonaguni206 株的同源性最高均為93.9%。結論經分子檢測證實云南臨滄地區耕牛體表微小牛蜱中存在一種類似日本Yonaguni206株的埃立克體感染，耕牛體表還可能寄生一種新的血蜱。

埃立克體; 蜱蟲; PCR檢測；基因序列分析; 云南臨滄

埃立克體(Ehrlichia，E)是一類嚴格的活細胞內寄生的原核細胞型微生物，為立克次體目無形體科埃立克體屬，包括犬埃立克體(E.canis)、查菲埃立克體(E.chaffeensis)、埃文埃立克體(E.ewingii)、鼠埃立克體(E.muris)、反芻動物埃立克體(E.ruminantium)等，主要侵犯白細胞和血小板，所引起的疾病稱埃立克體病(Ehrlichiosis),該病是由蜱蟲傳播所致的一類人獸共患自然疫源性疾病[1-2]。云南省素有動植物王國之稱，宿主動物及媒介昆蟲異常豐富，蜱蟲種類至少46種,居我國首位[3]，存在恙蟲病、斑疹傷寒、斑點熱、Q熱、萊姆病、森林腦炎等多種立克次體疾病和蜱傳疾病[4-6]。以往有人從云南軍犬和人群發現埃立克體抗體以及從云南蜱蟲檢測到埃立克體核酸[7-8]，提示我省可能存在埃立克體病自然疫源地。臨滄地區位于云南省的西南部，瀾滄江畔，屬橫斷山系怒山山脈的南延部份，亞熱帶低緯度山地季風氣候，自然環境獨特復雜，是我省立克次體病主要流行區[9]，當地立克次體病漏診和誤診較為嚴重。為此，對云南臨滄地開展?？舜误w調查，為?？舜误w病有效防治提供參考。

1　材料與方法

1.1樣本來源及形態學鑒定分組2011年在云南省臨滄地區耕牛體表采集蜱蟲42只，置液氮保存。據蜱形態學特征，參考文獻[10]描述在放大鏡下觀察初步鑒定，用75%乙醇消毒蜱蟲后，用生理鹽水清洗2次后晾干，然后將同種類的蜱蟲以2只為一組進行分組編號。

1.2PCR檢測以生理鹽水作為研磨液將分組后的蜱分別用乳缽研磨，取60 μL研磨懸液，采用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega公司)按說明書操作提取DNA。應用文獻[11-13]中的引物及條件對蜱COI基因以及埃立克體16SrRNA和groEL基因進行擴增，引物由上海生工公司合成。PCR反應總體積為50 μL，應用Promega公司GoTaqGreen Master Mix試劑盒在Biometra TProfessional PCR儀中進行PCR擴增，以無菌水作為陰性對照，無陽性對照。PCR擴增時取5 μL被檢樣本DNA為模板，6 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，DL2000 DNA Marker 來自于大連寶生物公司。

1.3DNA序列測定及分析PCR陽性產物送上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。通過Internet網進入美國國家生物技術信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用“BLAST”做序列比對,然后采用DNAStar中的MegAlign軟件對序列進行同源性比較，并利用SeqMan軟件對序列進行拼接，運用MEGA6.06軟件Neighbor-joining(Bootstrap: 1,000 replicates)法構建系統進化樹。

2　結　果

2.1形態學鑒定分組共采集42只蜱，分成21組，其中血蜱4只分成2組，編號為LCT1-2，占9.52%;微小牛蜱38只分成19組，編號為LCT3-19，占90.48%。

2.2蜱COI基因檢測及序列分析在21組樣本中,檢出COI片斷(660 bp) 21份，檢出率100%(見圖1)。根據蜱蟲COI基因部分序列(570 bp)進行基因序列分析，結果顯示檢出的COI片斷序列中有2份序列LCT1和LCT2的同源性100%，其余19份序列LCT3-21之間的同源性均為100%。LCT3與馬來西亞微小牛蜱B3的同源性最高達99.5%，與中國微小牛蜱9023(湖北)和YN010(云南)的同源性分別為94.0%、93.7%。LCT1與澳大利亞pava血蜱(JX573136)的同源性最高為89.3%，與羅馬尼亞嗜群血蜱 bb.f.79.2 和bb.f.79.1的同源性分別為89.1%、89.0%，與中國長角血蜱1511(河南)和SD154(山東)的同源性分別為84.8%、84.4%，與中國內蒙全溝硬蜱(JF758629)的同源性均為84.1%，與LCT3的同源性為83.2%。

注：M: DL2000 DNA Marker; 1-21: LCT1-21; N: 陰性對照圖1　PCR檢測蜱蟲COI基因片斷結果Fig.1　Results of PCR detection for tick COI fragments

2.3埃立克體16SrRNA基因及序列分析在21組樣本中，檢出16SrRNA片斷389 bp 4份(LCT3、LCT16、LCT17、LCT20)，檢出率19.05%?；蛐蛄蟹治鲲@示，檢出的4份16SrRNA片斷序列(356 bp)之間的同源性均為100%，與美國查菲埃立克體Arkansas和埃文埃立克體Aa2FT349及中國北京查菲埃立克體BY-YQ-HME-O18株的同源性均為100%，與日本埃立克體Yonaguni206和中國云南埃立克體Yunnan株的同源性均為99.2%，與日本埃立克體Yonaguni138株的同源性為98.9%，與西班牙犬埃立克體105株的同源性為98.6%，與中國新疆嗜吞噬細胞無形體D1株的同源性為94.5%。

2.4埃立克體groEL基因及序列分析在21組樣本中，檢出groEL片斷528 bp 4份(LCT3、LCT16、LCT17、LCT20)，檢出率19.05%(見圖2)?；蛐蛄蟹治鲲@示，檢出的4份groEL片斷序列(422 bp)之間的同源性均為100%，與日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138 株的同源性最高均為94.3%，與美國埃文埃立克體(AF195273)株的同源性為93.9%，與美國查菲埃立克體Arkansas株的同源性為91.5%，與中國云南埃立克體Yunnan株的同源性為91.0%。

注：M: DL2000 DNA Marker; 1: LCT6; 2: LCT2; 3: LCT19; 4: LCT1;5: LCT15; 6: LCT7; 7: LCT3; 8: LCT11; 9: LCT5;10：LCT20.圖2　PCR檢測埃立克體groEL基因片斷部分結果Fig.2　Partial results of PCR detection for Ehrlichia groEL fragments

針對groEL基因進行PCR基因序列檢測，應用SeqMan軟件拼接序列得到1 249 bp，并遞交GenBank得到基因注冊號KF977220，經序列分析顯示LCT20(KF977220)與日本埃立克體Yonaguni206株的同源性最高達93.9%(氨基酸序列同源性97.8%)，與日本埃立克體Yonaguni138株的同源性為93.7%(氨基酸序列同源性97.5%)，與美國埃文埃立克體(AF195273)的同源性為93.3%(氨基酸序列同源性97.3%),與美國查菲埃立克體Arkansas株的同源性為91.7%(氨基酸序列同源性96%)。

2.5系統進化樹分析根據蜱蟲COI基因部分序列(570 bp)進行系統發生樹分析，結果顯示LCT3與馬來西亞微小牛蜱B3在同一分支上，與中國湖北微小牛蜱9023和云南YN010不在同一分支上，表明LCT3與馬來西亞微小牛蜱B3的親緣關系較近，而與湖北微小牛蜱9023和云南YN010的親緣關系較遠。LCT1與澳大利亞pava血蜱(JX573136)及羅馬尼亞嗜群血蜱 bb.f.79.2 和bb.f.79.1不在同一分支，表明LCT1與澳大利亞pava血蜱(JX573136)及羅馬尼亞嗜群血蜱 bb.f.79.2 和bb.f.79.1的親緣關系較遠(見圖3)。

圖3　根據蜱蟲基因COI部分序列構建系統發生樹Fig.3　Phylogenetic tree of partial segments of tick COI gene

根據埃立克體16SrRNA基因部分序列(356 bp)進行系統發生樹分析，結果顯示LCT20與美國查菲埃立克體Arkansas和埃文埃立克體Aa2FT349及中國北京查菲埃立克體BY-YQ-HME-O18等株在同一分支上，與西班牙犬埃立克體105、日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138及中國云南埃立克體Yunnan株不在同一分支，表明LCT20與美國查菲埃立克體Arkansas、中國北京查菲埃立克體BY-YQ-HME-O18、美國埃文埃立克體Aa2FT349等株的親緣關系較近，與西班牙犬埃立克體105、日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138及中國云南埃立克體Yunnan株的親緣關系較遠(見圖4)。

圖4　根據埃立克體16S rRNA基因部分序列構建系統發生樹Fig.4　Phylogenetic tree of partial sequences of Ehrlichia 16S rRNA gene

根據埃立克體屬groEL基因部分序列(1 249 bp)進行系統發生樹分析，結果顯示LCT20與日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138株不在同一分支上，表明LCT20與日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138株的親緣關系較遠 (圖5)。

圖5　根據埃立克體groEL基因部分序列構建系統發生樹Fig.5　Phylogenetic tree of partial sequences of Ehrlichia groEL gene

3　討　論

近年來，隨著新的蜱傳立克次體及其疾病在全球不斷的涌現，新的疫區不斷的擴張，蜱傳疾病對人類所造成的危害也越來越大[14-15]，尤其是我國自從2006年首次證實人粒細胞無形體病例的存在[16]，隨后相繼報道了大量的蜱傳病例[5]。云南為我國立克次體病多發省份，近年我省恙蟲病、鼠型斑疹傷寒等立克次體病例逐漸增多，時有散發和地方性暴發疫情出現，而且漏診和誤診較為嚴重[17-19]，但是目前還沒發現埃立克體病和無形體病病例的報道。以往已從我省犬和人群檢測到埃立克體抗體，蜱中檢測到埃立克體核酸，鼠中檢測到無形體核酸[7-8,20]，這些提示我省可能存在埃立克體和無形體病自然疫源地。

本次調查發現云南臨滄地區農戶家養耕牛體表寄生有微小牛蜱和血蜱，其中微小牛蜱占90.48%為優勢蜱種。經分子生物學鑒定微小牛蜱COI基因部分序列與馬來西亞微小牛蜱B3的同源性最高為99.5%，而與中國湖北微小牛蜱9023和云南YN010的同源性僅分別達94.0%、93.7%；本次血蜱與澳大利亞pava血蜱(JX573136)的同源性最高為89.3%，而與中國河南長角血蜱1511的同源性為84.8%。進化樹分析顯示該血蜱與澳大利亞pava血蜱的親緣關系較遠，提示本次采集到的血蜱很可能為血蜱屬中的一種新的種類。

埃立克體16SrRNA基因高度保守，是目前最常用于PCR檢測的目的基因。本次應用PCR擴增16SrRNA基因，結果檢出4份16SrRNA片斷序列(檢出率19.05%)，它們與美國查菲埃立克體Arkansas和埃文埃立克體Aa2FT349及中國北京查菲埃立克體BY-YQ-HME-O18等株的同源性均為100%，而與日本埃立克體Yonaguni206和中國云南埃立克體Yunnan株的同源性均為99.2%。埃立克體groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性，因此groEL基因常用作分子流行病學研究和菌種鑒定的靶基因。本次檢出4份groEL片斷422 bp序列，它們之間的同源性均為100%，并與日本埃立克體Yonaguni206和Yonaguni138 株的同源性最高均為94.3%，與中國云南埃立克體Yunnan株的同源性僅為91.0%。針對groEL片斷基因進行檢測得到1 249 bp序列(LCT20/KF977220)，經分析顯示該序列與日本埃立克體Yonaguni206株的同源性最高達93.9%(氨基酸序列同源性97.8%)，與日本埃立克體Yonaguni138株的同源性為93.7%(氨基酸序列同源性97.5%)，與美國埃文埃立克體(AF195273)的同源性為93.3%(氨基酸序列同源性97.3%)，與美國查菲埃立克體Arkansas株的同源性為91.7%(氨基酸序列同源性96%)。由于GenBank中查不到云南株埃立克體相關序列，在這里無法與以往云南株作比較分析。結果表明本次檢測出的埃立克體流行株與日本Yonaguni206株相似，但遺傳進化差異較大，可能為埃立克體的一個新種。這為進一步埃立克體病疫源地調查提供了病原線索，具有重要的流行病學意義。

云南臨滄地區為高原地帶，自然環境獨特復雜，植被繁多，宿主動物及媒介昆蟲異常豐富，當地村民居住區四周被大山和植被環繞，人們生活條件較差，極易與蜱蟲直接或間接接觸而感染疾病。蜱傳立克次體病在臨床上大多表現非特異性，極易與其它發熱性疾病相混淆，延誤診治可致嚴重并發癥甚至死亡[15,17]。微小牛蜱在云南省家養耕牛中普遍存在、且種群比例居首位[21]，本次調查發現當地農戶家養耕牛體表寄生的優勢蜱種微小牛蜱存在自然感染埃立克體的現象，然而本次檢測到的埃立克體流行株是否致病、當地人群中是否存在埃立克病以及其分布情況等一系列問題尚不清楚。因此，為了防治埃立克體病，進一步開展埃立克體相關調查及研究十分有必要。

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Molecular identification of tick species and sequence analysis ofEhrlichiain Lincang area of Yunnan Province，China

YA Hong-xiang，ZHANG Yun-zhi,WANG Jing-lin

(YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention/YunnanProvincialKeyLaboratoryofNaturalFocalDiseaseControlandPrevention，Dali671000，China)

To investigate tick species andEhrlichiainfection among ticks in Lincang area of Yunnan province，42 ticks were captured from body surface of farm cattle and divided into 21 groups by morphological identification. Partial COI segments of ticks and 16S rRNA and groEL segments ofEhrlichiawere amplified separately by polymerase chain reaction (PCR)，and the homology were sequenced and analyzed with other known sequences. Among them，90.48% (38/42) ticks were identified asBoophilusmicroplus and 9.52% (4/42) ticks asHaemaphysalisby morphological identification. The 21 out of 21 groups samples were positive for ticksCOIfragments (detection rate，100%)，4 forEhrlichia16S rRNA fragments (detection rate，19.05%) and 4 forEhrlichiagroEL segments (detection rate，19.05%). Sequence analysis showed that 2 fragments of 21COIsequences andHaemaphysalispava(JX573136) from Australia showed higher nucleotide homology，all reaching up to 89.3%. The 19 fragments of 21COIsequences andBoophilusmicroplusB3 from Malaysia showed higher nucleotide homology，all reaching up to 99.5%. FourEhrlichia16S rRNA fragments andE.chaffeensisArkansas strains from USA，andE.chaffeensisBY-YQ-HME-O18 stains from Beijing of China，andE.ewingiiAa2FT349 strains from USA showed higher nucleotide homology，all reaching up to 100%. FourEhrlichiagroEL fragments and E. ssp. Yonaguni206 stains from Japan showed higher nucleotide homology，all reaching up to 93.9%. It’s confirmed by molecular identification that the epidemicEhrlichiainfectedBoophilusmicroplus from body surface of farm cattle in Lincang area of Yunnan Province were similar to Japan Yonaguni 206 strains，in addition，a new local Haemaphysalis may exist in this region.

Ehrlichia; tick; PCR detection; gene sequence analysis; Lincang area of Yunnan Province

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.006

亞紅祥，Email:yahongxiang@163.com

云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技術重點實驗室，大理671000

R384.4

A

1002-2694(2016)09-0793-05

2016-03-03；

2016-07-05