微囊法棘球蚴繼發感染小鼠動物模型的建立

王　慧，李　軍，郭寶平，溫　浩，張文寶

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微囊法棘球蚴繼發感染小鼠動物模型的建立

王慧，李軍，郭寶平，溫浩，張文寶

目的通過體外培養原頭蚴發育成微囊，經腹腔注射建立穩定的細粒棘球蚴和多房棘球蚴繼發感染小鼠動物模型。方法無菌條件下采集羊源細粒棘球絳蟲原頭蚴和鼠源多房棘球絳蟲原頭蚴，經胃蛋白酶消化后檢測蟲體活力并計數，于37℃、5%CO2條件下進行體外培養至發育成微囊，以每鼠50個微囊的劑量經腹腔注射的途徑分別接種BALB/c小鼠。接種6個月后，通過腹部解剖大體觀察和病理檢測分析各組小鼠的感染情況及包蟲囊的生長情況。結果原頭蚴在體外培養60d時發育成微囊，顯微鏡下觀察Eg具有明顯的透明角質層結構，而Em微囊角質層較薄。小鼠細粒棘球蚴和多房棘球蚴的感染率均為100%，Eg包蟲囊為游離單囊，成囊率達70%，囊內無原頭蚴；Em包蟲囊為類似腫瘤的團塊狀組織，病灶內有生發囊及原頭蚴。結論采用微囊法可建立穩定的棘球蚴繼發感染小鼠動物模型，為疫苗研制、藥物篩選和療效判定提供研究動物模型。

細粒棘球蚴；多房棘球蚴；原頭蚴；微囊；小鼠；感染動物模型

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱為包蟲病，是由棘球絳蟲幼蟲寄生于人體及某些哺乳類動物體內所致的一種嚴重的人畜共患慢性寄生蟲疾病，呈世界性分布[1-3]。目前認為可引起人體包蟲病的棘球絳蟲主要有兩種，即由細粒棘球絳蟲(Echinococcosgranulosus,Eg)引起的囊型包蟲病(Cystic echinococcosis, CE)和由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,Em)引起的泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis, AE)。兩型包蟲病在我國危害嚴重，防治研究刻不容緩[4-7]。而目前關于棘球蚴病的診斷，治療和控制存在著諸多問題，比如：在診斷方面，尚無用于大面積篩選的免疫診斷試劑盒；在治療方面，無有效的治療藥物；在控制方面，有限的控制手段很難解決控制所面臨的問題。因此，更加迫切需要對該病的致病機理、預防控制等進行系統和深入的研究。然而從臨床上很難獲得足夠的包蟲材料進行相關研究工作，理想動物模型的制備則顯得尤為重要。

目前，國內外學者已通過大量嘗試，對不同感染動物的種類和品系以及接種途徑進行了相關研究，初步建立了棘球蚴原發[8-10]和繼發感染動物模型[11-17]。原發性感染模型制作過程需要收集蟲卵，實驗環境和操作人員存在被污染和感染的危險。繼發性感染主要包括腹腔、皮下以及肝臟穿刺注射原頭蚴等多種途徑，但感染周期較長，成囊率較低，往往需要注射較大劑量的原頭蚴才能保證建模成功，對研究包蟲所致的免疫調節相關研究有一定影響。因此，本研究基于以上研究目的，擬從自然感染Eg的綿羊肝臟及實驗室Em保種的灰倉鼠中分別分離Eg和Em原頭蚴，體外培養發育成囊，經腹腔注射途徑低劑量接種小鼠，以期為包蟲病防治研究建立穩定且合適的動物模型，為進一步深入研究棘球絳蟲生長發育、藥物篩選等奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物本研究選用BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，雌性，6～8周齡，體重18～22 g，SPF級，飼養于新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心。本研究獲得了新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物使用與管理委員會(ICUC)的批準(批準號為：IACUC-20140424008)，樣本取材程序符合新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會標準，實驗嚴格遵循動物實驗的相關倫理學標準執行，在實驗過程中使用鎮痛劑，最大限度的減少小動物的術后疼痛。

1.1.2棘球蚴原頭節分別采集于新鮮自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟和新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物科學部腹腔接種泡球蚴傳代的灰倉鼠中。

1.1.3主要試劑消毒碘伏(新疆新特藥房)，75% 醫用酒精、0.9%生理鹽水、無水乙醇(烏魯木齊市謙誠醫療器械有限公司)，Hank’S液、磷酸緩沖鹽溶液、青/鏈霉素溶液、RPMI-1640培養基、胎牛血清(HyClone)，酵母粉(OXOID公司)，臺盼藍染色液(西化儀(北京)科技有限公司)，胃蛋白酶、亞甲基藍、甲苯胺藍、D-葡萄糖(Sigma-Aldrich公司)，4%多聚甲醛、戊二醛，Harris氏蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠(北京中杉)等。

1.2方法

1.2.1棘球蚴原頭蚴的制備Eg原頭蚴采集于自然感染的綿羊肝臟，清潔臟器表面，于無菌條件下吸取囊液，剪開包囊的頂部取出內囊于一無菌平皿中，用帶有雙抗的無菌PBS液反復吹打沖洗3遍，收集蟲體沉淀。Em原頭蚴采集于腹腔感染Em6個月以上的灰倉鼠中，無菌條件下取出腹腔中的病灶組織置于含PBS溶液的平皿中剪碎，將剪碎的泡球蚴組織置于100目的鋼網上充分碾磨，收集獲得的組織懸液，用PBS溶液洗3遍以上，收集蟲體沉淀。分別加入終濃度為1%的胃蛋白酶(pH 2.0)于37℃消化15～30 min，消化結束后用帶有雙抗的無菌PBS液再洗3～5遍，沉淀原頭蚴，并分別計數和計算活力。

1.2.2棘球蚴原頭蚴的體外成囊培養分別按2 000枚/mL的培養密度接種于含20%胎牛血清的RPMI-1640為主的培養液中，于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養，每3 d更換一次培養液，顯微鏡下觀察并記錄原頭蚴生長發育情況。

1.2.3實驗動物接種將體外培養獲得的Eg和Em包蟲囊，直徑約200～300 μm，定義為微囊。用無菌PBS溶液洗3遍以上，以每鼠50個微囊的劑量，通過腹腔注射的途徑分別接種BALB/c小鼠，制備小鼠棘球蚴繼發感染模型。

1.2.4小鼠繼發感染模型大體觀察腹腔接種6個月后分別對其進行剖檢取材和鑒定。采用頸椎脫臼法處死，剖開腹腔觀察體內感染情況，測量包囊大小并計數、拍照和記錄。

1.2.5小鼠繼發感染動物模型組織學鑒定將腹腔內的棘球蚴病灶組織取出，用生理鹽水清洗后加入4%的多聚甲醛固定，進行常規的石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察包蟲囊結構并采集圖像。

2　結　果

2.1棘球蚴體外成囊培養觀察經亞甲基藍染色顯示本次采集的Eg和Em原頭蚴的活力均在98%以上，原頭蚴伸縮蠕動明顯，部分原頭蚴外翻，頂突和4個吸盤完全翻出，高倍鏡下頂突小鉤結構清晰可見，體節內鈣顆粒明顯(圖1)。體外培養60 d后，原頭蚴發育分化形成微囊，顯微鏡下可見Eg微囊外圍具有明顯的透明角質層結構；而Em微囊角質層較薄，結構不明顯(圖2)。

圖1　Eg和Em原頭蚴體外培養形態學觀察Fig.1　Morphology observation of culturing protoscoleces of E. granulosus and E. multilocularis in vitro respectively (1 d).

圖2　Eg和Em原頭蚴體外成囊培養形態學觀察Fig.2　Morphology observation of culturing protoscoleces to producing hydatid cysts of E. granulosus and E. multilocularis in vitro respectively (60 d)

2.2微囊法建立小鼠棘球蚴繼發感染模型大體觀察在感染6個月后進行剖解觀察，發現Eg和Em感染率為100%。接種Eg微囊的小鼠感染模型中，小鼠腹部增大明顯，腹腔中的包蟲囊為游離的單囊，成囊率達70%，包蟲囊外觀晶瑩剔透，囊壁發白，囊內液體清亮，包蟲囊體積較大，平均直徑約為4.4±1.8 mm(圖3 A,B)；而接種Em微囊的小鼠感染模型中，小鼠腹部亦明顯增大，但腹腔中的包蟲囊為類似腫瘤的一些團塊樣病灶組織，團塊組織上附有血管生成(圖3 C,D)。

A、B為細粒棘球蚴(Eg)；C、D為多房棘球蚴(Em)E. granulosus (A&B); E. multilocularis(C&D)圖3　微囊法建立小鼠棘球蚴繼發感染模型的大體觀察Fig.3　Morphology observation of hydatid cysts of E. granulosus and E. multilocularis in animal model

2.3微囊法建立小鼠棘球蚴繼發感染模型組織學觀察對接種后分離到的Eg和Em的包蟲囊組織進行固定、石蠟包埋和HE染色，結果顯示：Eg微囊接種小鼠形成的包蟲囊具有典型的無細胞薄片層結構，囊內無生發囊及原頭蚴產生。Em微囊接種小鼠形成的包蟲囊生發層細胞豐富，組織中可見生發囊及原頭蚴產生(圖4)。

GL:生發層；LL:薄片層；PSC：原頭蚴；BC：生發囊GL: germinal layer; LL: laminated layer; PSC: protoscoleces; BC：brood capsule圖4　微囊法建立小鼠棘球蚴繼發感染模型的組織學觀察(HE染色，200X)Fig.4　Histological observation of hydatid cysts of E. granulosus and E. multilocularis in animal model

3　討　論

棘球絳蟲生活史復雜，需經歷不同的中間宿主和終末宿主才能完成其生活史，其發育經歷了蟲卵→六鉤蚴→囊泡→成蟲等多個階段，各個發育階段形態差異明顯[18-19]。為了能夠且便于在實驗室研究棘球蚴病的病原生物學特性，棘球蚴感染后宿主的代謝機能、免疫功能的變化，從而進一步了解該病的致病機理，急需建立合適的棘球蚴感染動物模型。

根據感染途徑的不同，棘球蚴感染動物模型分為兩類，即原發感染動物模型和繼發感染動物模型[8-17]。原發模型通過口服蟲卵感染，能夠模擬自然感染的狀態，但制作過程中需要收集蟲卵，容易造成周圍環境的污染，且實驗相關研究人員也存在被感染的危險以及實驗周期較長等，故采用較少；繼發感染模型包括腹腔注射、皮下注射、直視下肝臟穿刺原頭蚴感染等多種感染途徑，其中腹腔感染是最為常用的一種方法。目前在實驗室的研究中，以小鼠作為中間宿主建立包蟲病繼發感染模型最大的一個障礙就是注射的原頭蚴僅僅只有1%～3%可發育成為包囊，因此需要較大的原頭蚴注射量才能保證模型的成功建立，這對于研究包蟲所致的免疫調節等相關研究有一定的影響。Zhang等[20]通過將體外培養56 d的細粒棘球蚴小包囊通過腹腔注射接種BALB/c小鼠，發現小鼠成囊率可達75%。本研究利用建立的棘球蚴體外成囊培養平臺，分別將細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲原頭蚴體外培養至200～300 μm的微囊，然后以每鼠腹腔注射50個微囊的劑量分別感染BALB/c小鼠，24周后解剖發現感染率均為100%，Eg包蟲囊仍為游離的單囊，成囊率為70%，遠高于采用腹腔注射原頭蚴的成囊率，與張文寶等[20]研究結果一致。Em腹腔中的包蟲囊則不是游離的單囊組織，而是類似腫瘤組織狀的大的團塊狀結構，團塊組織上附有豐富的血管生成，與臨床表現相吻合。病理學檢測結果顯示，Eg微囊接種小鼠所形成的包蟲囊具有典型的無細胞薄片層結構，囊內無生發囊及原頭蚴的產生，而Em微囊接種小鼠形成的包蟲囊組織中則有生發囊及原頭蚴產生。隨后，課題組采用低劑量(5個微囊)、中劑量(25個微囊)、高劑量(50個微囊)3種不同劑量接種了300只小鼠，對此造模方法進行了驗證，發現感染率均為100%，表明采用微囊法建立小鼠Eg和Em繼發感染模型可作為疫苗研制、藥物篩選以及免疫學研究較為適合的動物模型。

通過本研究，我們發現實驗小鼠同樣接種的是Eg和Em游離的單個微囊，感染的劑量相同，但感染后所形成的病理表現卻截然不同，與臨床表現一致。我們認為是寄生蟲在宿主體內長期寄生的過程中不斷分泌和排泄的抗原物質，在宿主和寄生蟲交互作用中起了非常重要的作用所致。因此，通過本研究建立的Eg和Em體外成囊培養模型，可獲得大量的、純度較高的棘球蚴分泌或排泄抗原，同時建立了與臨床表現相吻合的動物模型，研究結果將有助于深入分析特定因子對棘球蚴生長發育的作用以及棘球蚴免疫逃避的分子致病機制，為抗棘球蚴藥物的篩選和疫苗的研制奠定了堅實基礎。

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Establishment of secondary hydatid disease infection in mice with cystic and alveolar Echinococcus cysts culturedinvitro

WANG Hui, LI Jun, GUO Bao-ping, WEN Hao, ZHANG Wen-bao

(StateKeyLaboratoryIncubationBaseofXinjiangMajorDiseasesResearch,ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

We established a stable mice model for cystic and alveolar echinococcosis (CE and AE) infection.E.granulosus(Eg) protoscoleces were aspirated and pooled from sheep liver hydatid cysts collected from a slaughterhouse in Urumqi.E.multilocularis(Em) protoscoleces were aspirated from hamster rats infected with protoscoleces ofEm. Pepsin digested protoscoleces of two species ofEchinococcuswere cultured to small cysts. BALB/c mice were each intraperitoneally (i.p) transplanted with 50 small cultured cysts ofEgorEm. Hydatid cysts were collected from the mice and processed for histopathological examination by HE staining after six month of transplantation infection. To evaluate the success of the established animal model for infection withEgandEm, the mice were sacrificed and the cyst number in each of the mice was counted. After 60 days culturedinvitro, we found that protoscoleces ofEgandEmwere differentiated into small cysts andEgcysts had a thicker cell free laminated layer compared to the laminated layer ofEmcysts. All the mice were infected successfully; the infection rates were 100%.Eghydatid cysts formed many single capsules in the peritoneal cavity of mice and we obtained a recovery rate (viability) of 70% in term of success of transplanted small cysts. However,Emhydatid cysts generated cell mass from the germinal layer which then formed brood capsules and produced protoscoleces observed in the small brood capsules. The process ofinvitrocultured protoscoleces ofEchinococcusremarkably increases the success of established cysts in mice.

Echinococcusgranulosus;Echinococcusmultilocularis; protoscoleces; small cysts; mouse, animal models

wenbaozhang2013@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.004

張文寶，Email: wenbaozhang2013@163.com

新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，新疆重大疾病醫學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，烏魯木齊830054

R383.3

A

1002-2694(2016)09-0784-05

2015-12-28；

2016-08-05

國家自然科學基金項目(No. U1303203，U1303222，31260272)；新疆重大疾病醫學重點實驗室開放課題(SKLIB-XJMDR-2015-Y4)；新疆醫學動物模型研究重點實驗室開放課題(XJDX1103-2013-09)

Supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (Nos. U1303203，U1303222，31260272);Open Project of Key Laboratory of Xinjiang Major Disease(No.SKLIB-XJMDR-2015-Y4)，the Open project of Key Laboratory of Xinjiang Medical Animal Model(No.XJDX1103-2013-09)