粉塵螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表達(dá)、純化鑒定及生物信息學(xué)分析

梁志林，劉志剛，鄔玉蘭，陳思敏，楊平常，劉曉宇

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粉塵螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表達(dá)、純化鑒定及生物信息學(xué)分析

梁志林，劉志剛，鄔玉蘭，陳思敏，楊平常，劉曉宇

目的克隆表達(dá)粉塵螨13.8 kDa 溶菌酶(Bac)基因, 純化鑒定蛋白的過(guò)敏原性, 并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法

粉塵螨；13.8 kDa 溶菌酶(Bac)；原核表達(dá)；免疫原性鑒定；生物信息學(xué)分析

在已知的數(shù)十種塵螨中,與人類(lèi)過(guò)敏性疾病關(guān)系最密切的主要有屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus, Der p)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae, Der f)，可誘發(fā)I型變態(tài)反應(yīng), 從而引起哮喘、過(guò)敏性鼻炎、異位性皮炎和蕁麻疹等多種過(guò)敏性疾病[1-2],是最重要的過(guò)敏原[3]。目前, 利用塵螨的主要過(guò)敏原來(lái)檢測(cè)塵螨過(guò)敏和進(jìn)行免疫治療是非常重要的手段。我國(guó)學(xué)者首次對(duì)粉塵螨基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究，并對(duì)Der f1-24進(jìn)行報(bào)道[4-5]，極大地豐富了塵螨過(guò)敏原基礎(chǔ)研究。本文利用基因工程技術(shù)克隆粉塵螨Bac基因，并利用pET-44a原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)及分析，獲得具有IgE結(jié)合活性的重組過(guò)敏原13.8 kDa 溶菌酶(Bac)，并對(duì)免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定；同時(shí)，用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究粉塵螨Bac過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要試劑和材料

1.1.1菌株和動(dòng)物粉塵螨(Der f)由深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所標(biāo)準(zhǔn)化純培養(yǎng)并提供，大腸桿菌E.coliTop10F’和E.coliBL21 (DE3) 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2質(zhì)粒和試劑原核表達(dá)載體p ET-44a為本研究室保存。限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和XhoI、T4 連接酶、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶等購(gòu)自Ta KaRa 公司。高保真Pfu DNA 聚合酶購(gòu)自Fermentas公司。RNA提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司。Ni2N TA resin及柱子購(gòu)自Amer sham Pharmacia公司。

1.1.3血清取自廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，臨床上選擇經(jīng)粉塵螨皮試陽(yáng)性的過(guò)敏性哮喘和過(guò)敏性鼻炎患者18例和粉塵螨皮試陰性的健康人10例。分別采集靜脈血各5 mL，經(jīng)37 ℃靜置4 h，然后5 000 × g離心5 min 收集上層血清,再選用法瑪西亞CAP 過(guò)敏原自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng),收集粉塵螨特異性IgE陽(yáng)性且反應(yīng)達(dá)3 級(jí)或3 級(jí)以上的患者血清10 例進(jìn)行混合,作為陽(yáng)性血清; 另取10 例粉塵螨特異性IgE 陰性的健康人血清10 例進(jìn)行混合,作為陰性血清,二者分裝后-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1RT-PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物的克隆以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系如下(50 μL)：10 × Ex Taq Buffer 5 μL；TaKaRa ExTaq 0.25 μL；dNTP Mixture，4 μL；上下游引物各2 μL，cDNA 為模板1 μL；加去離子水至50 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；35 個(gè)循環(huán)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖電泳驗(yàn)證并拍照。將上述PCR 產(chǎn)物與pMD-18T 連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coliTop10 中，涂布于含氨卞霉素( 100 mg/L)的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，從LB 平板上挑選白色菌落放入含氨卞霉素的LB 培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。 用BamHI酶切鑒定，重組質(zhì)粒，委托華大基因工程(深圳)有限公司進(jìn)行序列。

1.2.2Bac蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將上述鑒定的pET44a-Bac轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 ( DE3)，待細(xì)菌生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期( A600nm=0.6～0.9) 時(shí), 加入20 μL 1 mol/L的IPTG, 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4 h后取1 mL 菌液，離心棄上清液, 加100 μL去離子水后重懸菌體，加20～25 μL 10×SDS-PAGE 上樣緩沖液混合, 沸水浴10 min，按照5 μL，10 μL，20 μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析, 以檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，經(jīng)裂解、溶菌、超聲，將上清液以2 mL/min 的速度上樣于已平衡好的Ni-NTA 柱。然后用平衡液充分洗柱，再分別用含40、300 mmol/L 咪唑平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集各次洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.3重組Bac蛋白的過(guò)敏原性鑒定將重組Bac蛋白以不同的濃度梯度包被微孔板，以對(duì)粉塵螨過(guò)敏的患者的血清作為一抗、以HRP抗人IgE為二抗建立了間接ELISA法進(jìn)行特異性檢測(cè)分析。

1.2.4重組Bac蛋白的生物信息學(xué)分析

1.2.4.1測(cè)定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析基因序列的測(cè)定送由深圳市華大基因有限公司進(jìn)行完成，Bac基因的同源性分析用NCBI 網(wǎng)站在線(xiàn)軟件分析其ORF，用Translate Tool 推導(dǎo)其氨基酸序列，用clustalw2進(jìn)行同源性分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST比對(duì)出與Bac蛋白序列相關(guān)性最強(qiáng)的10個(gè)蛋白質(zhì)序列，用MEGA5 工具包來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4.2Bac蛋白的理化性質(zhì)用PmtParam對(duì)塵螨Bac蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4.3Bac的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)用PSIPRED預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu),用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)；選取與人類(lèi)哮喘相關(guān)的等位基因，利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 IEDB內(nèi)相關(guān)軟件、Preprod在線(xiàn)預(yù)測(cè)工具對(duì)Bac蛋白T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用DNAStar軟件提供的Protean模塊對(duì)Bac的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR 擴(kuò)增Bac片段，表達(dá)載體pET44a-Bac 的構(gòu)建以純培養(yǎng)的活粉塵螨提取的總RNA為模板，進(jìn)行設(shè)計(jì)的特異性引物為上下游引物，再以反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板擴(kuò)增得到約為400 bp的片段，大小與預(yù)期相符(圖1)。將Bac目的基因經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切并克隆到pET-44a表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒pET44a-Bac。

M: DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:擴(kuò)增的Bac基因M: DNA marker; 1: PCR prouct from Bac.圖1　目的基因的RT-PCR產(chǎn)物Fig.1　PCR product of ferritin from Bac

2.2重組蛋白的表達(dá)和純化含有pET44a-Bac的表達(dá)菌株經(jīng)終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,考馬斯亮藍(lán)染色, 結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆菌株在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr) 約14 kD處有外源蛋白表達(dá)的條帶出現(xiàn), 其Mr與預(yù)計(jì)值相符(圖2)。

M: Protein Marker；1:純化的重組Bac蛋白M: Protein marker；1: Purification protein.圖2　重組Bac蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2　SDS-PAGE of protein which had been purified

2.3重組Bac蛋白ELISA免疫原性鑒定選用粉塵螨過(guò)敏患者陽(yáng)性血清作為一抗，以HRP抗人IgE為二抗，采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，鑒定結(jié)果顯示重組Bac與塵螨過(guò)敏患者陽(yáng)性血清的IgE特異性結(jié)合活性明顯高于正常對(duì)照者血清的IgE結(jié)合活性(t=43.970,P<0.01)(圖3)。

A：粉塵螨過(guò)敏患者陽(yáng)性血清；B：正常對(duì)照組血清A: Positive serum; B: Normal serum.圖3　Bac蛋白ELISA免疫原性鑒定結(jié)果Fig.3　Immunogenicity appraisal result of ELSIA

2.4粉塵螨Bac蛋白生物信息學(xué)分析

2.4.1測(cè)定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析測(cè)得的13.8 kDa溶菌酶(Bac)的基因序列為“atggatggttcacatattgtaaaggcagcacgatcacaaattgg tgtaccatattcatggggtggtggtggtattcatggtaaatccaaaggta ttggtgaaggtgcaaatatcgttggatttgattgttctggattggcacaa

tattccatttatcagggaacacataaaacaattgctcgtacagctgcagc

acaatataatgataaccattgtcatcatgttgcatacggtagtcatcaacc aggtgatctggtatttttcggtaatccaatctatcatgttggtattgtatc

ggcacatggtcgtatggtcaatgcacctaaacccggtactaaagttcgt gaagaaaatatttggagttatcatatttctcatgttgctcgatgttggtaa”。將推導(dǎo)出的Bac蛋白的氨基酸序列輸入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)分析，同源序列以Fasta格式輸出后用MEGA5．1軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)(圖4)，結(jié)果顯示粉塵螨與屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，gi|540198595|、gb|AGV05390.1|、gi|22595340|、gb|AAN02509.1|AF409109)親緣關(guān)系比較近；同時(shí)，Bac蛋白在鏈霉菌屬(Streptomyces，gi|917111437|ref|WP 051718149.1|)、南海海洋所菌屬(Sciscionella，gi|521987581|ref|WP 020498852.1|)、綠僵菌屬(Metarhizium，gi|743660388|、gb|KID87636.1|、gi|734664381|、gb|KHO01427.1|)、彎頸霉菌屬(Tolypocladium，gi|908391921|、gb|KND92543.1|)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana，gi|667658361|ref|XP 008601012.1|、gi|400595504|、gb|EJP63299.1|)和蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris，gi|573987537|ref|XP 006671689.1|)中有類(lèi)似的表達(dá)。

圖4　Bac的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4　Phylogenetic relationship of Bac

2.4.2Bac的理化性質(zhì)用PmtParam對(duì)塵螨Bac蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，推測(cè)該蛋白的分子式為C627H944N188O178S5，原子總數(shù)為1 942，分子質(zhì)量是 14 123.8，理倫等電點(diǎn)9.08；該蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%；負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為7，正電荷氨基酸殘基數(shù)為11，總的平均疏水性為0,320，脂肪指數(shù)為70.00，不穩(wěn)定指數(shù)是31.63，按ProtParam定義，不穩(wěn)定系數(shù)分值小于40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白較穩(wěn)定，故Bac蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定。

圖5　Bac二、三級(jí)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)圖

2.4.3Bac的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)將Bac的氨基酸序列輸入到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器中(PSIPRED)，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(圖5A)。用同源模建法，提交序列到SWISS-MODEL服務(wù)器進(jìn)行自動(dòng)模建，得到其三維結(jié)構(gòu)。其結(jié)果與所選取X-衍射得到的模板序列相似性為40.32%(圖5B)。二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)都表明Bac主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。用 網(wǎng) 絡(luò) 服 務(wù) 器 IEDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)、 Preprod對(duì) Bac蛋白 T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)得到 4個(gè)肽序列(6-14、38-46、85-99和122-130)。利用DNAStar軟件預(yù)測(cè)Bac的B細(xì)胞表位。蛋白質(zhì)的親水性、表面可及性、柔韌性等在抗原的形成方面發(fā)揮著重要的作用,當(dāng)親水性>0，抗原指數(shù)>0，表面可及性>l時(shí)，形成表位的可能性大，綜合其上各參數(shù)可推導(dǎo)出該蛋白的抗原區(qū)分別為氨基酸的15-30、 26-40、44-59、58-73、95-110和101-116(圖5為Bac蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，T細(xì)胞、B細(xì)胞表位見(jiàn)圖5。

3　討　論

塵螨普遍存在于人類(lèi)居住環(huán)境中，可引起人體許多過(guò)敏反應(yīng)如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎等[1]，塵螨是導(dǎo)致過(guò)敏性疾病最重要的吸入性變應(yīng)原(過(guò)敏原)，約有70%～80%的哮喘患者對(duì)塵螨過(guò)敏[2]。屋塵螨(Der p)和粉塵螨(Der f)是我國(guó)室內(nèi)最主要的兩種優(yōu)勢(shì)螨種，目前研究發(fā)現(xiàn)塵螨含有Der 1-24種過(guò)敏原，其中Der f2和Der p2對(duì)過(guò)敏性疾病(哮喘)患者免疫診斷陽(yáng)性率最高[3-4]。Der p2對(duì)過(guò)敏性疾病(哮喘)患者免疫診斷陽(yáng)性率為87.8%[6]。近50年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者在對(duì)當(dāng)?shù)貕m螨進(jìn)行眾多的種類(lèi)調(diào)查、抗原分析純化等工作的基礎(chǔ)上，制備出粉塵螨過(guò)敏原浸液用于臨床特異性診斷和免疫治療(脫敏治療)，并取得了較好的療效[7]。塵螨疫苗特異性免疫治療是WHO認(rèn)可的目前治療塵螨過(guò)敏性哮喘唯一的對(duì)因治療方法，其主要機(jī)制包括調(diào)節(jié)機(jī)體抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)，轉(zhuǎn)換相關(guān)抗體亞型，抑制過(guò)敏性炎癥效應(yīng)細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)等[9-10]；即主要通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答來(lái)發(fā)揮對(duì)因治療作用[11]。故對(duì)塵螨過(guò)敏原的深入研究將有助于塵螨過(guò)敏診斷和免疫治療。

粉塵螨溶菌酶(Bac)屬于N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶家族，Childs M和Erban T等研究發(fā)現(xiàn)，塵螨可利用其溶菌酶消化芽孢桿菌，作為自身的食物來(lái)吸取養(yǎng)分[10-11]。本研究克隆粉塵螨Bac的DNA基因序列全長(zhǎng)為396 bp，可編碼131個(gè)氨基酸。分子進(jìn)化遺傳分析(molecular evolutionary geneticsanalysis，MEGA)工具包結(jié)果顯示粉塵螨與屋塵螨的親緣關(guān)系最近，粉塵螨Bac基因與屋塵螨中的LytFM基因(gb|KF113885.1|)同源性高達(dá)96%。利用間接ELISA法，證實(shí)粉塵螨Bac蛋白與塵螨過(guò)敏患者血清IgE具有特異性結(jié)合的能力。

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是研究生物信息的采集、處理、存儲(chǔ)、傳播，分析和解釋等各方面的學(xué)科，是通過(guò)基因序列可預(yù)測(cè)其相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要工具[12]。本文通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)粉塵螨Bac的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞、B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示Bac蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%，蛋白較穩(wěn)定。二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)都表明Bac要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成?？乖砦皇强乖肿又袥Q定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，包括B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位為可被 T細(xì)胞表面受體或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的片段，重疊肽法或酸洗脫法是傳統(tǒng)的確定T細(xì)胞表位的方法，但這兩種方法耗費(fèi)畢竟大。利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行 T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)能大幅度提高工作效率，可以有效節(jié)約研究成本，本文用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器IEDB數(shù)據(jù)庫(kù)、Preprod對(duì)粉塵螨Bac蛋白的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)得到4個(gè)肽序列；可被B細(xì)胞表面受體或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的片段為B細(xì)胞表位；利用DNAStar軟件進(jìn)行Bac蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)得到6個(gè)肽序列。本研究為進(jìn)一步研究粉塵螨過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。

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Cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and analysis of the Bac protein

LIANG Zhi-lin, LIU Zhi-gang, WU Yu-lan, CHEN Si-min, YANG Ping-chang, LIU Xiao-yu

(InstituteofAllergyandImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

The aim for this study is cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and conducting bioinformatics analysis of the Bac protein. Total RNA was extracted from cultured dust mites. The primers designed according to sequences was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pMD32-T vector, and then subcloned into pET-44a vector by restriction endonucleaseEcoR I andXhoI. The recombinant plasmid pET44a-Bac was transformed intoE.coliBL21 and was induced with IPTG. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was used to test the allergen of Bac and the clustalw2 was used to conducted homology analysis and MEGA5 to construct phylogenetic tree of Bac. ProtParam tools were used to predict its physical and chemical properties. PSIPRED and SWISS-MODEL were used to predict its secondary structure and tertiary structure. IEDB and Preprod was used to analyze the T cell antigen epitope. DNAStar was used to analyze the B cell antigen epitope of Bac. After sequencing, we have successfully cloned the Bac gene, and the open reading frame was 396 bp, encoding 131 amino acid group.The Bac gene was transferred intoE.coliBL21 (DE3). After induction with IPTG, Bac protein was largely expressed. The protein mainly existed in soluble form; protein molecular weight was about 14 kDa. The indirect ELISA method results showed that Bac could bind with dust mite allergic patients serum IgE. Comparing the clonedDerfBac amino acid sequence with other mites, we found that its homology with NCBI accession number KF113885.1 was 96%. The molecular evolutionary tree analysis showed that Bac had a close relationship withDermatophagoidespteronyssinus. The physical and chemical properties prediction showed Bac protein was stable. The prediction of the secondary and tertiary structure indicated that Bac mainly consisted of random coil. Bioinformatics analysis predicted four peptides (6-14, 38-46, 85-99, 122-130) as the T cell epitopes and six peptides (15-30, 26-40, 44-59, 58-73, 95-110, 101-116) as the B cell epitopes. We have successfully cloned and expressed the Bac, and confirmed that the recombinant Bac protein has good immunogenicity. The study provides a basis for further study of composition and physicochemical properties of house dust mite allergen.

Dermatophagoidesfarina; 13.8 kDa lysozyme (Bac); expression; immune identification; bioinformatics

Liu Xiao-yu, Email: lxy0901@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.003

劉曉宇，Email：lxy0901@163.com

深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)和免疫學(xué)研究所，深圳 518060

R392.8

A

1002-2694(2016)09-0779-05

2015-10-31;

2016-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.91442118、No.31400786)、廣東省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.2013B03180002)、廣東省對(duì)外科技合作項(xiàng)目(No.2013B051000088)、廣東省公益研究與能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(No.2013B031800023)、深圳市科技計(jì)劃國(guó)際科技合作項(xiàng)目(No.GJHZ20130408174112021)和深圳市科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.JCYJ20140828163633992)聯(lián)合資助

挑取經(jīng)純培養(yǎng)的粉塵螨，提取總RNA，根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增Bac基因片段，產(chǎn)物連入pMD-32T載體中。擴(kuò)增后，利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切將目的基因片段連接到Pet-44a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21( DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；間接ELISA法檢驗(yàn)重組Bac蛋白特異性過(guò)敏原性；clustalw2進(jìn)行同源性分析，MEGA5工具包來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，ProtParam Tools 預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，PSIPRED預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 IEDB內(nèi)相關(guān)軟件和Preprod，對(duì)Bac蛋白T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。用DNAStar對(duì)Bac的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果經(jīng)測(cè)序鑒定，本研究成功克隆出了粉塵螨Bac基因，其開(kāi)放閱讀框396 bp，編碼131組氨基酸。將Bac基因?qū)氪竽c桿菌E.coliBL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)Bac重組蛋白。該蛋白主要以可溶性形式存在，蛋白分子量約14 kDa。間接ELISA法證明Bac能與粉塵螨過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合。測(cè)序發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室克隆的粉塵螨Bac基因與GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性為96%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示粉塵螨與屋塵螨親緣關(guān)系比較近。理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示Bac蛋白質(zhì)較穩(wěn)定。二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Bac的結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲組成。T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)得到 4個(gè)肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)得到6個(gè)肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。結(jié)論成功克隆并表達(dá)了粉塵螨Bac，并證實(shí)重組Bac蛋白具有良好的免疫原性，為進(jìn)一步研究塵螨過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)成分及其理化性質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

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