VDR基因FokⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病易感性的關(guān)系

劉玉,古麗巴哈·買買提，嚴(yán)媚，王珍珍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊830054)

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VDR基因FokⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病易感性的關(guān)系

劉玉,古麗巴哈·買買提，嚴(yán)媚，王珍珍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊830054)

目的探討維生素 D 受體(VDR)基因FokⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病(AL)的關(guān)系。方法 采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科AL患兒125例(維吾爾族60例，漢族65例)及130例(維吾爾族63例，漢族67例)同期健康體檢兒童，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法檢測(cè)VDR基因FokⅠ多態(tài)性。結(jié)果 新疆維吾爾族及漢族健康兒童FokⅠ的基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.289，P=0.193)，但其等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.882，P=0.028)。在維吾爾族AL患兒和健康兒童中TT/CC+CT基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.089，P=0.297),等位基因分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.133，P=0.144)。在漢族AL患兒和健康兒童中TT/CC+CT基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.453，P=0.011)，等位基因分布差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.239，P=0.001)。結(jié)論VDR基因FokⅠ多態(tài)性分布在AL患兒中存在民族差異；VDR基因FokⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族AL患兒無明顯相關(guān)性，而與漢族兒童AL的發(fā)生具有相關(guān)性。

維生素D受體;基因多態(tài)性；兒童；白血??；維吾爾族；漢族；新疆

維生素D是脂溶性維生素，對(duì)人類健康特別是對(duì)兒童健康具有重要意義。維生素D缺乏除了導(dǎo)致鈣、磷代謝異常外，還可影響神經(jīng)、肌肉、免疫、造血等多種組織器官的功能[1]?；钚跃S生素D主要是通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。王哲等[2]研究顯示，VDR是維生素D作用于細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，VDR或者其天然配基1,25-羥基維生素D3可以調(diào)節(jié)腫瘤的生長。近十幾年來，人們先后在多種白血病細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)有VDR表達(dá)。因此，我們有理由認(rèn)為白血病細(xì)胞是維生素D和VDR作用的靶細(xì)胞，VDR基因可能是白血病的易感基因。目前，有關(guān)VDR基因在兒童白血病中的研究報(bào)道甚少。本研究意在闡述VDR基因Fok Ⅰ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病(AL)易感性的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年9月～2015年1月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科住院的125例AL患兒，男58例，女67例；年齡28 d～14歲，平均3.56歲；維吾爾族60例，漢族65例；個(gè)體間均無血緣關(guān)系。所有病例通過MICM分型，并除外其他癌癥及合并糖尿病、心血管疾病等。選取同期在兒科預(yù)防保健門診體檢的130例非白血病兒童作為對(duì)照，男63例，女67例；年齡28 d～14歲，平均3.56歲；維吾爾族63例，漢族67例。AL患兒與健康兒童性別、年齡、民族組成具有可比性(P均>0.05)。

1.2VDR基因FokⅠ多態(tài)性分析方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法。PCR 上下游引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，限制性內(nèi)切酶由美國 MBI公司生產(chǎn)，PCR Master Mix及100 bp DNA Ladder Marker、10×TBE電泳緩沖液由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)。瓊脂糖和溴化乙錠(EB)分別由Biowest公司和Sigma 公司生產(chǎn)。采集外周新鮮靜脈血 1～2 mL，EDTA抗凝，進(jìn)行DNA提取。引物序列：通過美國國家生物信息中心 (NCBI)的GeneBank獲取VDR基因序列及Fok Ⅰ位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性信息，利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列。FokⅠ上游引物5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′，下游引物5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系包括DNA模板0.2 μg，上下游引物各0.2 μL，Premix Taq 10 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)總體積至20 μL。將以上體系首先94 ℃預(yù)變性5 min；然后 94 ℃變性 45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸 5 min，共 30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 5 min形成PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR-RFLP 分析：取 PCR 產(chǎn)物 10 μL，加入 0.2 U相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)的緩沖液，恒溫 37 ℃水浴箱中酶切 90 min。酶切產(chǎn)物于 2%的瓊脂糖凝膠上電泳 30 min，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。隨機(jī)抽取經(jīng) PCR-RFLP 確定的不同基因型的 PCR 產(chǎn)物各 2 例送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Chromas軟件讀出后與 GeneBank 的序列進(jìn)行對(duì)比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。先對(duì)健康兒童行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，對(duì)不同組的基因型和等位基因分布比較均采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1VDR FokⅠ基因型分析結(jié)果VDR基因FokⅠ的第2外顯子位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)應(yīng)FokⅠ的酶切位點(diǎn)，為堿基T→C的突變。等位基因無酶切位點(diǎn)的純合子僅出現(xiàn)265 bp 1條條帶，表示為TT；只有1個(gè)酶切位點(diǎn)的雜合子出現(xiàn)265、207、60 bp 3條條帶，表示為CT；有2個(gè)酶切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)207、60 bp 2條條帶，表示為CC。見圖1。

注：M為Maker；1為CC等位基因，表現(xiàn)207、60 bp 2條條帶；4為CT等位基因表，現(xiàn)為265、207、60 bp 3條條帶；2、3為TT等位基因表現(xiàn)為265 bp 1條條帶。

圖1VDR的PCR產(chǎn)物經(jīng)FokⅠ酶切后的電泳圖

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果將健康兒童中漢族及維吾爾族兒童的FokⅠ基因位點(diǎn)的實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.140，P=0.932,χ2=0.060，P=0.970)，表明FokⅠ基因位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見表1。

2.3VDR基因FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性在健康兒童漢族及維吾爾族中的分布新疆維吾爾族及漢族健康兒童FokⅠ的基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.289，P=0.193)，但其等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.882，P=0.028)。見表2。

表2　 　　　FokⅠ基因多態(tài)性在健康兒童漢族及維吾爾族兒童中的分布(例)

2.4 VDR基因FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性在AL患兒和健康兒童的分布 在維吾爾族AL患兒和健康兒童中TT/CC+CT基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.089，P=0.297),等位基因分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.133，P=0.144)。在漢族AL患兒和健康兒童中TT/CC+CT基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.453，P=0.011)，等位基因分布差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.239，P=0.001)。見表3。

表3　VDR基因FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性在AL患兒和健康兒童的分布(例)

3　討論

白血病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括物理、化學(xué)、生物及遺傳因素等。分子生物學(xué)研究已證明，AL的本質(zhì)是多基因異常引起的惡性腫瘤，涉及到許多癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，是一個(gè)多步驟的過程[3,4]。目前研究顯示，遺傳易感性和環(huán)境因素是兒童白血病發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵因素。多基因遺傳病易感基因的定位和遺傳分析，是近年來白血病多基因遺傳易感性的研究重點(diǎn)。

在肺癌、結(jié)腸癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤生長過程中，VDR均具有調(diào)節(jié)控制作用。劉靜波等[5]研究顯示，VDR基因FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能關(guān)聯(lián)，提示VDR基因多態(tài)性與肺癌的發(fā)生之間存在明顯相關(guān)性。有研究顯示，VDR基因多態(tài)性與乳腺癌存在一定的相關(guān)關(guān)系[6]。研究顯示，廣西地區(qū)健康兒童FokⅠ多態(tài)性與國內(nèi)其他地區(qū)人群VDR基因位點(diǎn)多態(tài)性分布情況基本一致[7～9]，明顯不同于印度人群[10]及西班牙人群[11]。國外有研究顯示[11]，F(xiàn)okⅠ的基因多態(tài)性位點(diǎn)在中國漢族人群與歐洲人群之間存在明顯差異，并認(rèn)為可能是中國人群結(jié)核病高發(fā)感染的原因之一。也有研究表明[12～14]，F(xiàn)okⅠ基因位點(diǎn)會(huì)影響兒童白血病的發(fā)病機(jī)制。

本研究通過對(duì)維吾爾族和漢族白血病患兒、非白血患兒的VDR不同基因型進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)維吾爾族和漢族患兒VDR不同基因型在白血病發(fā)生中的重要作用。在兒童白血病方面，鄭敏等[9]在廣西漢族白血病患兒VDR基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)okⅠ位點(diǎn)TT基因型在AL患兒的分布較健康兒童明顯增高；與CC基因型相比，TT基因型患AL的風(fēng)險(xiǎn)性增加(OR=2.260,P<0.05)；與C等位基因相比，攜帶T等位基因的個(gè)體更易罹患AL(OR=1.556,P<0.05)。國外的研究顯示[15]，F(xiàn)okⅠ酶切位點(diǎn)的多態(tài)性與兒童白血病的遺傳易感性有關(guān)。國外有體外細(xì)胞研究證實(shí)，維生素D抵抗會(huì)誘導(dǎo)生成白血病腫瘤細(xì)胞，VDR基因FokⅠ位點(diǎn)的多態(tài)性與白血病腫瘤細(xì)胞的分化形成之間關(guān)系密切[16]。在本研究中，VDR基因FokⅠ的TT/CC+CT基因型分布在非白血病患兒中不存在民族差異，但其等位基因分布存在差異，提示T及C等位基因組合的不同可產(chǎn)生不同的表型。TT/CC+CT基因型和等位基因分布在維吾爾族AL患兒和健康兒童中分布相近，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于漢族兒童而言，TT/CC+CT基因型和等位基因分布在AL患兒和健康兒童中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與文獻(xiàn)[7～9]結(jié)論相似。提示VDR基因FokⅠ基因位點(diǎn)與新疆地區(qū)漢族兒童AL的發(fā)生具有相關(guān)性。提示不同地區(qū)、不同人種等的遺傳因素可能不同，加之環(huán)境因素的差異，以及環(huán)境與遺傳因素間的相互作用又使情況更復(fù)雜，從而導(dǎo)致上述結(jié)果。本研究?jī)H限于對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的兒童，受樣本量的限制，本研究尚顯不足，有待進(jìn)一步研究。

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新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研項(xiàng)目(2012QN04)。

嚴(yán)媚(E-mial: yan10mei25@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.029

R725.5

B

1002-266X(2016)34-0076-03

2015-12-27)