結直腸癌錯配修復蛋白和微衛星不穩定檢測的對比分析

陳瓊榮　王滿香　郭芳　況晶　方娜　王明偉　金蘇　吳德　鄧云特魏少忠

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結直腸癌錯配修復蛋白和微衛星不穩定檢測的對比分析

陳瓊榮1王滿香1郭芳1況晶1方娜1王明偉1金蘇1吳德1鄧云特1魏少忠2

目的 目前最常用的篩查結直腸癌DNA錯配修復基因缺失的方法是免疫組化檢測錯配修復（MMR）基因相關蛋白的表達，以及基于PCR檢測多個微衛星位點判斷有否微衛星不穩定（MSI）這2種方法，本研究主要目的是比較這二種檢測之間的一致性，并對分子病理室作室內質量控制。方法 收集2014年8月至2015年10月湖北省腫瘤醫院結直腸癌368例手術切除標本，免疫組化常規檢測癌組織MLH1，PMS2，MSH2及MSH6這4種蛋白的表達。免疫組化顯示任一蛋白完全缺失，判讀為MMR蛋白缺失（dMMR）；如癌細胞4個MMR有多少不等的核著色，判讀為MMR無缺失（pMMR）。選取其中的65例行PCR-毛細管電泳法檢測MSI，其中28例為pMMR，37例為dMMR。然后對這65例組織用PCR毛細管電泳法檢測Bethesda推薦的5個微衛星位點。比對這65例患者上述二種檢測結果之間的一致性，并分析、整理其臨床病理特征。結果 368例結直腸癌中有37例免疫組化結果為dMMR中，其余331例為pMMR。37例中剔除2例后對其中35例行毛細管PCR法檢測，顯示高頻MSI者32例，微衛星穩定（MSS）者3例。選取331例中的28例行PCR檢測，顯示MSS者27例，MSI-H者1例。免疫組化法檢測的敏感度和特異性分別為97.0%和90.0%，PCR檢測結果的敏感度和特異性分別為91.4%和96.4%；二者總的一致性為93.7%。伴MSI的結直腸癌原發灶以右半結腸最多見（占48.6%），病理形態以低分化腺癌伴淋巴細胞浸潤和粘液分泌最常見，病理TNM分期以Ⅱ期和Ⅲ期為主。結論 免疫組化檢測MMR蛋白和基于PCR的毛細管電泳法檢測MSI二者的一致性高，其中免疫組化法可以作為臨床初篩結直腸癌微衛星不穩定性的一種經濟而便捷的方法，值得推廣。

結直腸腫瘤； 免疫組織化學； 微衛星不穩定； 錯配修復蛋白

大約有15%的結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是經由微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）途徑發生的，而DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）基因的表達缺失、引起DNA復制過程中錯配累積是MSI發生的原因［1］。Lynch綜合征是由MLH1、PMS2、MSH2、MSH6等MMR基因發生胚系突變所致的一種常染色體顯性遺傳病，除了發生結直腸癌外（約占全部CRC的2%～4%），還可發生子宮內膜癌、膽管細胞癌等腸外腫瘤［1-2］。如果由于MLH1基因啟動子發生甲基化使該基因沉默、發生微衛星不穩定性而致的CRC，人們稱之為散發性MSI性結直腸癌，約占全部CRC的12%左右［1，4］。

根據微衛星不穩定程度可分為：高頻微衛星不穩定（MSI-H），低頻微衛星不穩定（MSI-L）和微衛星穩定（MSS）。至少1個錯配修復基因缺失（MMR deficient，dMMR），表現為MSI-H；錯配修復基因無缺失（MMR proficient，pMMR）時表現為MSI-L或MSS［3-4］。TNM Ⅱ期或Ⅲ期的CRC伴MSI-H的患者預后更好，但接受5-FU為基礎的輔助化療并不獲益，而對含奧沙利鉑或伊立替康的化療有效［5-6］。2015年新英格蘭醫學雜志報道了一組使用PD1抑制劑pembrolizumab治療伴MSI-H的晚期、難治性結直腸癌患者，獲得了驚人的效果，開創了這類患者接受腫瘤免疫治療的先河，也使得臨床普遍開展結直腸癌MMR或MSI檢測更具臨床意義［7］。

目前國內市場上已有商品化的、針對MLH1，PMS2，MSH2及MSH6這4種MMR蛋白的特異性單克隆抗體，自動化免疫組化儀器的廣泛使用也使得這種檢測結果穩定、可靠性強，因此包括湖北省腫瘤醫院在內的國內多家大型三甲醫院的病理科已常規開展這種免疫組化檢測［8-9］。此外，分子病理室也能開展基于毛細管電泳的PCR法直接檢測常見微衛星位點的不穩定性，為這類特殊類型的CRC篩查提供依據［8-9］。正是基于此背景，湖北省腫瘤醫院病理科從2013年8月即開始對所有結直腸癌手術標本行免疫組化檢測上述4種MMR蛋白，并選擇dMMR和部分pMMR者行PCR毛細管電泳法檢測MSI。本文既是對我們前一階段的這兩種檢測結果的比對分析，以了解IHC與PCR的一致性、可行性以及經濟實用性，也是對分子病理室的一次質控分析。

資料與方法

一、一般資料

收集湖北省腫瘤醫院2014年8月至2015年10月手術切除的368例結直腸癌標本。一般資料包括性別，年齡及臨床病理資料等。

二、方法

10%中性磷酸緩沖福爾馬林液固定24 h～48 h，常規脫水、固定、石蠟包埋，免疫組化常規檢測如下4種MMR蛋白（MLH1，PMS2，MSH2及MSH6）的表達。MLH1，鼠單抗，克隆號ES05，即用型；PMS2，兔單抗，克隆號EP51，即用型；MSH2，鼠單抗，克隆號FE11，即用型；MSH6，兔單抗，克隆號EP49，即用型，上述一抗均為DAKO產品。所用二抗是DAKO EnVisionTM二步法抗兔、鼠通用型免疫組化試劑，所用免疫組化儀是DAKO AutostainerLink 48。每張切片含有的正常腸黏膜、腫瘤間質細胞、炎癥細胞作為內對照（核陽性著染）。依據文獻判讀免疫組化染色結果［10］：內對照細胞核陽性而癌細胞全陰性（即沒有1個細胞核著色）時，表明該蛋白表達缺失。兩個病理主治醫師（王滿香和郭芳）閱片，如果有分歧，請第三個高年資病理醫師（陳瓊榮，消化腫瘤亞專業）裁決。

在這368例接受MMR檢測的病例中，選擇dMMR者（37例），或有一項MMR蛋白表達弱于內對照、或患者年齡小于50歲、或有明顯的家族史者（即部分pMMR），共28例，行PCR-毛細管電泳檢測MSI：選取每例癌組織豐富的蠟塊以及相應的遠癌切端腸壁組織塊做對照，每個蠟塊切10張4 μm厚組織，刮取細胞豐富區，用Qiagen公司的石蠟組織DNA提取試劑盒（德國）提取DNA；采用上海源奇公司生產的MSI檢測試劑盒擴增Bethesda推薦的5個標準微衛星位點（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346及D17S250）［11-12］，其中BAT25、BAT26為單核苷酸重復序列，D2S123、D5S346、D17S250為雙核苷酸重復序列。美國ABI公司的Applied Biosystems 3500基因分析儀檢測熒光標志的PCR產物長度并用GeneMapperV4.1軟件分析結果。如果這5個位點中有任何2個或以上的位點不一致（即≥40%），即評判為MSI-H；只有1個位點不一致，判為MSI-L；無位點偏移者判為MSS［11-12］。

收集上述做MSI檢測的65例CRC患者的臨床信息：患者年齡、性別、癌灶發生的部位，并顯微鏡下觀察癌組織的分化程度、淋巴細胞浸潤情況并按照美國癌癥聯合會（American Joint Committee On Cancer，AJCC）標準評估pTNM分期［13］。

結　果

一、MMR蛋白免疫組化染色結果

368例接受MMR蛋白免疫組化染色中，所有內對照（正常黏膜腺體和腫瘤間質成分）細胞核著色呈棕褐色，有37例癌組織中至少1種MMR蛋白完全不著色，判讀為MMR蛋白缺失（dMMR）。其中1例放療后直腸癌和另1例混合性腺神經內分泌癌被剔除，剩余35例dMMR。這35例中MLH1和PMS2聯合缺失者21例（圖1 A、1 B、1 C），MSH2和MSH6聯合缺失者9例（圖1 D、1 E、1 F），有3例顯示PMS2單一缺失，2例顯示MSH6單一缺失。

二、PCR-毛細管電泳法及與免疫組化檢測結果一致性的分析

35例免疫組化檢測結果為dMMR中，PCR檢測顯示MSI-H者32例（圖2），MSS者3例。選取免疫組化顯示無MMR蛋白缺失者（pMMR）28例作PCR-毛細管電泳法檢測Bethesda推薦的5個微衛星位點，結果為MSS者27例，MSI-H者1例。我們假定PCR法檢測結果為真，分析免疫組化法的敏感度和特異性分別為97.0%和90.0%，二者總的一致性為93.7%（表1）。從另一個角度分析，即假定IHC檢測結果為真，分析PCR檢測結果的敏感度和特異性分別為91.4%和96.4%，二者總的一致性為93.7%（表2）。

三、臨床病理資料

上述63例既做了MMR又做了MSI檢測的CRC患者中，男性患者43人，女性20人，男女之比約2：1。年齡27～84歲，中位年齡57歲。發病部位以右半結腸為主，免疫組化檢測結果為dMMR的35例CRC患者中，右半結腸癌（其中升結腸癌和回盲部癌18例，橫結腸癌2例）20例，占57.1%；其次是直腸癌8例，占22.9%；其他左半結腸（降結腸3例，乙狀結腸4例）7例，占20.0%。35例dMMR結直腸癌中，以MLH1和/或PMS2缺失為主，共有24例（其中PMS2單一缺失3例）；而MSH2和/或MSH6缺失者只有11例（其中MSH6單一缺失2例）。這35例dMMR的CRC中，低分化或中分化腺癌伴明顯腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）者13例，部分粘液腺癌13例（其中5例合并低分化腺癌），純粘液腺癌3例，中分化或高分化腺癌且不伴黏液分泌、或不伴明顯淋巴細胞反應者共11例。這35例CRC中病理TNM分期為I期者2例，II期者23例，III期者10例。

討　論

用免疫組化檢測結直腸癌MMR蛋白的表達以及PCR檢測MSI位點的方法是WHO以及各類指南推薦的篩查Lynch綜合征的方法，二者之間的一致性也很高［1-4，8-9，11-12，14-16］。湖北省腫瘤醫院從2013年8月即開始對所有結直腸癌手術標本行免疫組化檢測上述4種MMR蛋白的表達，并對其中dMMR或可疑Lynch綜合征者行PCR毛細管電泳檢測MSI以進一步確證MMR檢測結果。對前一階段這兩種檢測結果比對分析并復習文獻后，我們發現二者之間的一致性高達93.7%，當然也發現了一些問題，為下一步改良我們的工作提供依據。

圖1　A、B、C顯示1例84歲女性患者右半結腸癌病理特征：A圖顯示低分化腺癌（HE 染色，×20倍）；B圖免疫組化判讀為PMS2缺失（IHC染色，×40倍）；C圖免疫組化MSH6表達正常（IHC染色，×40倍）。D、E、F顯示另1例27歲男性患者右半結腸癌病理特征：D圖顯示中分化腺癌伴粘液成分（HE染色，×100倍）；E圖免疫組化判讀為MSH6缺失（IHC染色，×100倍）；F圖免疫組化MLH1表達正常（IHC染色，×40倍）

在368例手術切除的結直腸癌病例中，我們用免疫組化的方法篩查出37例MMR蛋白至少有一項完全缺失者，約占全部CRC病例的10.0%，低于國外文獻的數據［17］，但與Ye等最近報道的中國結直腸癌人群的數據相當［18］。剔除其中放療后直腸癌和混合性腺神經內分泌癌各1例后，只對35例進一步MSI檢測和臨床病理分析，發現最常見的是右半結腸癌占57.1%，這一點與文獻報道一致［19］；而直腸癌位居第二，這可能與我國直腸癌發病率相對較高有關［20］。其他臨床病理特征，如中-低分化腺癌伴淋巴細胞浸潤、純粘液腺癌或合并粘液腺癌、病理TNM分期以II期和III期為主等，與文獻報道均相符［19，21］。此外，我們還發現37.1%的dMMR癌組織中伴有豐富的淋巴細胞浸潤，這也為這類CRC今后接受腫瘤免疫治療提供了證據［7，22-23］。

對比分析免疫組化檢測MMR與PCR-毛細管電泳法檢測MSI的結果，發現二者敏感度和特異性均在90%以上，二者之間的一致性高達93.7%。相對而言，免疫組化的敏感度高于PCR，而特異性相反。我們的結果與大多數文獻一致［4，15，19，21］。因此，用簡便而經濟的免疫組化檢測結直腸癌組織MMR蛋白可作為一種初篩的手段，易于在各病理實驗室開展［15］。但我們在核查檢測結果的時候，發現有3例初始IHC檢測判讀為dMMR，做PCR檢測發現是MSS，然后復閱IHC切片，發現有2例內對照陽性很弱，后重復IHC檢測后判讀為pMMR；另1例僅有不足10%的癌細胞陽性但閱片時漏診而致假陰性判讀。復習文獻發現也有類似的報道［10，15，24］。因此，為了得到可靠的MMR免疫組化檢測結果，我們認為必須注意如下幾點：（1）選擇帶正常腸黏膜且癌組織豐富的切片做IHC染色；（2）加強免疫組化技術的質量控制，從標本的切開、固定、到免疫組化操作過程（比如一抗的修復和濃度的摸索、DAB顯色時間的控制等），均需嚴格質控［25］；（3）最好由相對固定的、認真負責且經驗豐富的消化病理醫師閱片判讀IHC結果［24］。

我們檢測的35例dMMR結直腸癌中，以MLH1和/或PMS2缺失最為多見（24例），這與文獻也是相符的［15，21，26］。另外，我們還發現MSH6單缺失有2例，其中1例是MSI-H，1例是MSS。文獻報道［27-30］孤立性的MSH6蛋白缺失時，由于其功能冗余，可能不足以導致MSI的發生；因此我們的檢測結果驗證了這一點，同時也說明PCR檢測微衛星不穩定性的敏感度難以達到100%，正如免疫組化檢測MMR缺失的敏感度也只有97.0%一樣［15］。

圖2　顯示1例57歲男性患者乙狀結腸癌組織和相應的正常遠癌切斷組織的PCR毛細管電泳法檢測Bethesda推薦的5個微衛星位點的檢測結果，紅色箭頭顯示癌組織的4個位點（D5S346，Bat-25，D17S250和Bat-26）相較于正常切端組織發生了位點偏移，判讀為MSI-H

表1　免疫組化檢測MMR蛋白比對PCR檢測MSI的分析（例）

表2　PCR檢測MSI比對免疫組化檢測MMR蛋白的分析（例）

因此，到目前為止，大多數文獻報道的MMR和MSI的檢測都不能達到100%的敏感度和特異性（相對于基因突變分析而言），但人們總在努力降低其假陰性和假陽性率，特別是針對花費比較高的MSI檢測。目前我們分子病理室選用的是Bethesda推薦的5個位點，但有很多文獻推薦檢測5個單核苷酸位點、6個甚至10個單和雙核苷酸位點的MSI檢測法，可以提高其敏感度和特異性［4，8，26，31-34］。此外，有學者提出用顯微切割技術選擇癌細胞豐富區做PCR，特別是對粘液腺癌的病例意義重大［34］；我們有1例粘液腺癌做免疫組化顯示很肯定的dMMR，但PCR檢測為MSS，我們推測這可能是由于送檢的癌組織量沒有達到70%而導致PCR檢測MSI假陰性的發生。

雖然我們客觀真實的總結了我們的數據以期跟同行分享我們的經驗，但本文也有明顯的局限性：（1）由于我們病例選擇有限，因此我們得到的數據可能存在偏倚；（2）PCR選擇的Bethesda推薦的5個位點，BAT25，BAT26是單核苷酸重復序列，另三個是雙核苷酸重復序列；而文獻建議檢測5個或6個的單核苷酸位點或單核苷酸聯合雙核苷酸的10個位點的PCR檢測［4，8，26，31-34］，可以明顯提高MSI檢測的敏感度和特異性。因此，下一步，我們將以本文的數據為依據，更新我們的MSI檢測；（3）本文中配對檢測MMR和MSI的63例結直腸癌組織沒有行相關基因測序分析，因此，對這兩種檢測結果的比對分析缺乏一個金標準，所得出的分析數據可能存在偏差；（4）對可疑Lynch綜合征的患者，我們只收集了其中部分患者的家族史信息，缺乏完整的家系調查結果，這也影響了本文分析的深度和廣度。

總之，本文是對我院病理科免疫組化檢測結直腸癌MMR蛋白、PCR-毛細管電泳法檢測MSI的一組對比分析，顯示這兩種方法檢測結果的一致性高達93.7%，二者相對的敏感度和特異性均達90%以上。其中免疫組化經濟、簡便，易于推廣，而且可以揭示缺失的基因種類，有利于下一步基因測序分析。此外，做好免疫組化和PCR檢測的質控和技術更新，加強對相關技術人員和醫師的培訓，盡量降低假陰性和假陽性的比率，這樣可望提高結直腸癌患者MMR/MSI的檢測的準確性。

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Testing mismatch repair proteins versus microsatellite instability in colorectal carcinoma

Chen Qiongrong1，Wang Manxiang1，Guo Fang1，Kuang Jing1，Fang Na1，Wang Mingwei1，Jin Su1，Wu De1，Deng Yunte1，Wei Shaozhong2.1Department of Pathology；2Department of Gastrointestinal Surgical Oncology，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430079，China

Wei Shaozhong，Email: weishaozhong@163.com

Objective Immunohistochemical（IHC） staining for mismatch repair （MMR） proteins and PCR-based detection for microsatellite status are routinely performed on colorectal carcinoma （CRC）surgical samples.However，the concordance of the two detections，which is related to the quality control of our molecular pathology laboratory，is unknown so far.So the main aim of this study is to compare the differences between the two analyses and to improve our work.Methods IHC analyzed the expression of MLH1，PMS2，MSH2 and MSH6 which was performed on 368 cases of formalin-fixed paraffin-embedded（FFPE） CRC tissues.If any one protein is negative in all of cancer cells but positive in normal colorectal mucosa，the IHC staining was reported as mismatch repair defective （dMMR）.If the four MMR proteinsare expressed in the nucleus of one or more cancer cells，the IHC result was interpreted as mismatch repair proficient （pMMR）.All of the 37 cases of dMMR and selected 28 cases of pMMR were tested by PCR-based MSI analysis.Paired normal and cancer DNA samples isolated from the FFPE tissues were tested for MSI using Bethesda recommended 5 markers （BAT25，BAT26，D2S123，D5S346，D17S250）.At last the results of IHC and PCR were compared and their concordance were analyzed.Results IHC analyses were performed on 368 cases of CRC，among which 37 cases were dMMR and 331 cases were pMMR.After excluding 2 cases from the 37 samples，the remained 35 samples were tested for MSI，among which 32 samples were high-level microsatellite instability （MSI-H） and 3 samples were microsatellite stable （MSS）.In addition，28 cases of pMMR samples were selected to be tested by PCR for MSI，among which 27 cases were MSS but one case was MSI-H.The sensitivity and specificity of immunohistochemistry was 97.0% and 90.0%，separately，the sensitivity and specificity of PCR was 91.4% and 96.4%，separately，and the total concordance of the two detections achieved 93.7%.The most common original site of dMMR CRC was right hemicolon （occupying 48.6%），and the most common pathological features included mucous adenocarcinoma，poor differentiated adenocarcinoma with lymphocytes infiltration，and pathologic TNM stage Ⅱ and stage Ⅲ.Conclusions The total concordance of the immunohistochemistry for MMR proteins and PCR-based MSI testing achieved 93.7%，and the former is an economic and quick screening method which is deserved to be popularized in China.Moreover，we have to emphasize the important role of intra and external laboratory quality control of the two methods and then to improve the process，so as to increase the testing accuracy.

Colorectal neoplasms； Immunohistochemistry； Microsatellite instability；Mismatch repair proteins

2016-05-15）

（本文編輯：關旭）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.05.006

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430079 湖北省腫瘤醫院病理科1；湖北省腫瘤醫院胃腸腫瘤外科2

魏少忠，Email：weishaozhong@163.com

陳瓊榮，王滿香，郭芳，等.結直腸癌錯配修復蛋白和微衛星不穩定檢測的對比分析［J/CD］中華結直腸疾病電子雜志，2016，5（5）：398-404.