結直腸癌的精準醫學：大數據和微進展的時代

魏少忠　胡勝

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結直腸癌的精準醫學：大數據和微進展的時代

魏少忠1胡勝2

胡勝主任醫師，現任湖北省腫瘤醫院內科主任。畢業于中山大學醫學院，2003年獲博士學位，2009年美國俄亥俄州立大學藥學院訪問學者，參與新型癌癥靶向藥物的研發。從事腫瘤臨床工作20年，擅長各種惡性腫瘤的個體化治療，對肺腫瘤、大腸腫瘤以及腦腫瘤都有深入研究。在腫瘤靶向治療和免疫治療研究中有較高造詣。學術兼職：中國抗癌協會生物治療專業委員會委員及中國抗癌協會化療專業委員會青年委員。長期從事癌癥的靶向治療和細胞免疫治療的基礎和臨床研究工作。目前重點從事惡性腫瘤的CAR-T細胞治療的相關研究。發表論文50余篇（SCI 6篇），專著2部，主持課題6項，參與課題8項。曾獲“武漢市科技進步獎”和“優秀醫務工作者”等稱號。兼任《中國腫瘤》、《腫瘤學雜志》及《腫瘤防治研究雜志》中英文審稿專家。

依據大數據為基礎的結直腸癌精準醫學是一個有吸引力的研究方向。雖然下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術發展迅速，但科學和實踐方面的挑戰導致臨床上進展微小。最大的挑戰是驅動突變的識別，因為除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS基因異常，結直腸癌沒有其他有效的致癌驅動突變存在。發展生物信息學工具，超深度測序和監測循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）方法，以幫助確定發生率微小的驅動突變，以及評估通路的激活，并進行聯合治療的方法，有助于在將來解決上述問題。大多數候選基因組改變的發生率微小，限制了精準醫學的臨床實踐。解決策略是發展個體化的籃子試驗或雨傘試驗。

結直腸腫瘤； 數據庫，核酸； 精準醫學； 微進展

在過去幾十年中，基因組學研究的發展進一步提示，癌癥是由不同的基因組異常驅動。不同的國際研究計劃，如癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）、國際癌癥基因組協會，或者基因組圖譜，都發現了結直腸癌的基因突變組景觀，揭示了每個結直腸腫瘤具有多個高水平的腫瘤分子異質性。其數據具有3V的特征：數據量大（volume of data），數據來源多（variability of data sources）和數據處理速度快（velocity of processing the data），即生命科學領域的大數據爆炸（圖1）［1］。計算機信息學、分子醫學和生物學、基因和基因組學的發展，對腫瘤學家最低學習要求是必須強制性繼教培訓和學習。

圖1　基因組學研究的發展

一、精準醫學的工具

從臨床實踐上看，檢測結直腸癌基因異常的方法，越來越細微。免疫組織化學方法檢測EGFR的表達，隨后熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）分析KRAS將結直腸癌患者進行分層。目前，也可以用于其它基因的檢測，如NRAS、FGFR1或CCND1。多基因測定法已經被開發，來量化基因表達，如RT-PCR（OncotypeDX?）、DNA陣列（Mammaprint?）或NanoString技術（ProsignaTM）。

雖然CRC主要遺傳變異已發現超過20年，引入下一代的測序（NGS）技術，以及來自全基因組獲得的數據關聯研究已經發現了大量與CRC相關的基因。NGS技術允許快速和精確癌癥基因組的分析，有針對性的基因分型在常規分子診斷中發揮著越來越重要的作用，促進癌癥精準醫學的發展［2］。超深測序可用于檢測微小亞克隆的改變，將調節靶向治療的繼發耐藥，同時，一些中心已開始在臨床使用全外顯子測序（whole-exome sequencing，WES）。RNA測序可以用于量化RNA表達和檢測結構變化，如突變和易位。ctDNA的檢測也是越來越流行，正在發展成為一種無創技術替代活檢［3］，監測參與耐藥的基因組改變。最后，鑒于核酸檢測技術不足以獲得腫瘤的全面分子譜，也需要考慮檢測蛋白表達模式。幾種技術正在開發，包括TheraLink測定法，其測量腫瘤樣品中磷酸化蛋白的水平，以確定該通路是否被激活。

二、基因組學在結直腸癌精準醫學中的應用

在轉移性結直腸癌中，目前基因組學的四個潛在應用，可以提高患者的治療效果。第一個是識別發生率更微小的致癌驅動突變。基因組驅動突變可以被定義為負責癌癥進展的分子變化，因此，以這種基因為靶點消除癌基因依賴，將會有明確的治療作用。大量研究已經發現，WNT、RAS-MAPK、PI3K、TGF-β、P53和DNA錯配修復（mismatch repair）通路是結直腸癌常見的驅動突變。高通量技術已確定其他潛在的發生率微小的驅動突變，是藥物的潛在靶點，如APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、TCF7L2和NRAS［4-7］。然而，識別基因組候選驅動突變的研究進展微小，尚無可預測靶向治療效果的驅動突變。也提示一些癌癥進展的驅動突變可在RNA/蛋白質水平進行檢測分析，而不僅在DNA水平。

在轉移性結直腸癌，基因組學的第二個可能的應用是識別參與繼發耐藥的基因組改變。在動物模型中，發現ERBB2、EGFR、FGFR1、PDGFRA和MAP2K1突變是原發耐藥的機制。通過進行ctDNA分析和超深度測序可以實時確定繼發突變事件；ctDNA的非侵入性的分析可能不僅早期發現異常基因的改變（甚至復發前），以及實時監測疾病的演變過程（與活檢組織的一次應用不同）。例如，研究發現結直腸癌患者突變狀態和蛋白質生物標志物濃度可以預測瑞戈非尼（regorafenib）的臨床療效［8］。

轉移性結直腸癌基因組學第三種應用是識別DNA修復缺陷。使用高通量WES分析43例患者的DNA修復通路，發現CDKN1B、XRCC4、EPHX1、NFKBIZ、SMARCA4和BARD1，參與DNA修復和細胞周期調節［9］。其他研究也發現，MMR突變在家族性結直腸癌發生率最高（10.9%），其他基因突變僅為3.3%［10］。

雖然基因測序有助于發現腫瘤DNA修復缺陷，并促進個體化治療策略，但進展微小。PARP抑制劑如奧拉帕尼（olaparib）應用于大多數修復DNA損傷相關的腫瘤。然而，MSI-H結直腸腫瘤患者，olaparib單藥并沒有明顯療效（與微衛星穩定患者比較）［11］。通過olaparib聯合放射治療，可能提高腫瘤殺傷作用，但毒性將增加。

晚期結直腸癌治療中，高通量技術的第四個潛在應用是在個體層面上識別免疫逃逸機制，這是最有希望的方向。抗PD1單藥治療結直腸癌，表現出抗腫瘤活性，客觀反應率為18.5%。然而，目前缺乏可能預測這類藥物療效的工具，而且也需要尋找靶點，開發其他免疫治療。

基因組學可以有效用于評估精密免疫醫學的5個不同方面：（1）從結直腸癌患者的研究已經提出，檢測新抗原和突變負荷可以預測免疫檢測點藥物的療效；（2）基因組學可以用來量化分析免疫檢測點蛋白及其配體（如PD-1/PD-L1）的表達；（3）測序和基因表達分析可以檢測抗細胞毒性T淋巴細胞（CTL）治療耐藥的癌細胞。例如，一些癌細胞存在TAP1突變或它們不表達MHCⅠ類分子，兩者均導致對CTL抵抗；（4）基因組學可以用于定量和定性分析局部免疫系統，如CD8+T細胞的滲透可以預測抗PD1治療的效果。最后，基因組學可以用于檢測遺傳多態性與免疫反應的水平和免疫缺陷關系。

早期檢測這些基因組改變，是否一定會改善臨床結果，在精準醫學領域仍然進展微小，是重大的挑戰之一。

三、精準醫學存在的挑戰和解決方法

盡管在癌癥中，高通量技術和多個應用方法持續進步，但一些挑戰需要解決，以提高結直腸癌的個體化治療。最重要的限制和一些可能的解決方案敘述如下。

（一）改善驅動突變的識別

開發結直腸癌精準治療的最大應用是提高抗腫瘤效果的幅度，因此，識別并鎖定基因組驅動突變的事件，并與乘客事件區分開是關鍵，但這顯然是一個相當大的難題。因為除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS，沒有任何測序的項目報告，已確認任何基因組改變可作為臨床前或臨床治療的靶點驅動突變。

最近，隨著人們大規模的測序和體細胞突變相關的分類，計算生物學方法不僅可以發現高度突變的基因，而且通過與背景突變率比較，發現基因突變的陽性選擇作用，以及基因表達水平和復制率，或突變的定位和對蛋白活性的預測。重要的是，這些方法也將有助于確定體細胞突變是否具有癌基因或腫瘤抑制的作用，從而作為開發靶向治療的依據。最后，雖然探索DNA方法很深入，要考慮RNA表達水平也很重要（例如通過基因表達陣列檢測），它已經被成功地用于識別腫瘤細胞的依賴基因，而且應與DNA突變進行整合，以更好地預測癌癥的通路。

（二）開發更特異的靶向藥物

結直腸癌未能提供個體化的醫學往往與缺乏高度的生物活性和特異藥物有關。例如，PIK3CA突變發生在約15%的晚期結直腸癌［12］，并已報道它是疾病的驅動突變。然而早期臨床試驗中，單獨使用非選擇性PI3K抑制劑表現為溫和的反應率（4%）。第二代α選擇性PI3K抑制劑特異性強，并且在動物模型體內產生更好的抑制。事實上，這些新抑制劑的初步結果表明，約7%的PIK3CA突變結直腸癌患者療效表現為疾病穩定時間≥6月。第二個重要問題是難以獲得適當或可用的藥物。的確，在SHIVA研究中，只有40%（293/741）的基因組改變患者能夠獲得靶向治療，而最終進行隨機化后這一數值僅為26%，提示基因組檢測只應該在一個可獲得藥物的范圍內進行。

因此，加快開發針對靶點的高特異性和生物活性的藥物尤為關鍵。

（三）抗腫瘤需要聯合治療

針對一個驅動突變應該表現為明顯的抗腫瘤反應，但是，腫瘤異質性可以導致原發耐藥。在體外和臨床試驗中，已發現兩個或多個異常癌癥相關基因與靶向治療耐藥相關［13］。

驅動突變的識別是靶向治療成功的關鍵，不過，值得提出的是，絕大多數晚期患者會出現繼發耐藥，這是腫瘤適應的結果。在治療的選擇壓力下，DNA或蛋白質水平改變，出現耐藥克隆擴增，導致高度可變的遺傳多樣性和復雜的克隆結果。此外，一些研究已經報道不同轉移部位的異質性，表現為不同的基因組變化，而如何處理這種水平的異質性，目前還不清楚。一項正在進行的臨床試驗（MATCH-R）對靶向藥物初始獲益后出現病情惡化患者的進展部位進行組織活檢，以探索參與耐藥發生的機制。針對不同的轉移進展部位的多個驅動突變，使用聯合治療。

腫瘤適應的第二個機制是替代蛋白網絡的激活，繞過靶向性抑制。在mTOR抑制劑治療的患者中，已經觀察到一個負反饋回路導致mTORC2激活AKT，誘導生長因子受體磷酸化（包括IGF-1R），需要聯合IGF-1R或PI3K抑制劑進行治療。此外，針對多個基因組改變的治療已經出現臨床客觀緩解，包括PIK3CA基因突變和DNA修復。而且，靶向治療的聯合，以及與免疫檢查點抑制劑的聯合，可能是根除腫瘤細胞的關鍵策略。

四、針對罕見（發生率微小）的基因突變的策略

（一）臨床研究的策略

精準醫學包括兩種不同的方法，即分層醫學和個體化醫學。分層醫學是在特定分子變化的人群中測試一個藥物，而個體化醫學是研究個體化治療是否提高了所有患者的療效。在晚期結直腸癌，對納入臨床試驗的所有患者進行篩查是分層醫學的主要限制，因為當前大多數候選驅動突變率小于10%。如果假設，FGFR1擴增率約為10%，而篩查的失敗率為15%左右，則共需要對8 294例患者進行篩查，以進行研究。分層醫學是目前結直腸癌研究的主導模式，但事實上，隨著技術的進步和生物進化，將檢測到罕見的基因組突變，從而導致患者入組更加困難。因此，結直腸癌的精準醫學需要開發更合適的個體化醫學模型，而不是分層醫學。

為了克服分層醫學試驗的患者入組問題，有五個可能的解決方案。首先，有必要按比例放大患者數目，篩選候選基因，以滿足隨后的治療試驗。有兩種不同類型的個體化醫學分子篩查方案：籃子試驗和雨傘試驗。籃子試驗在多種癌癥中檢測單個藥物對一個分子變化的效果。此設計可允許更快的識別候選患者，隨后在不同類型腫瘤中評估靶向治療的潛在價值。在NCI-MATCH跨腫瘤類型的個體化醫學研究計劃中［14］，包括3 000例不同類型的癌癥（如結直腸癌），以便找到有效的靶向治療藥物。另一項STARTRK-2籃子試驗正在根據所有實體瘤（主要是結直腸癌和肺癌患者）的NTRK1/2/3，ROS1或ALK狀態探索Entrectinib的療效。

第二個解決方案是聚集幾個基因組改變作為一個單一的預測因子，例如PTEN/PI3K/Akt和Wnt/ β-catenin通常關聯性強，在臨床試驗中可檢測PI3K抑制劑的療效。

第三種方法是在術前狀態開發大多數的藥物。藥物開發過程通常包括幾次試驗，驗證概念，劑量優化，生物標志物驗證和發展聯合方案。早期結直腸癌占50%，多次試驗可以在手術前患者中進行，而不是在轉移性疾病中進行，將加快藥物開發。

第四種潛在的解決方案是使用新型臨床前模型（例如患者來源異種移植物和離體循環腫瘤細胞培養物）。使用循環結直腸腫瘤細胞體外的基因組測序，以確定預先存在或新獲得的分子改變，并進行藥物敏感度測試，以確定最佳的個體化治療。

此外，基于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結果的藥品批準可以大大加速藥物的開發，如肺癌的ALK抑制劑。實例中顯示，這種方法首先需要發現預后很差的相關亞型，如RAS突變型結直腸癌患者。

（二）進行合適的方法檢測基因組突變

雖然結直腸癌患者分層醫學的最大挑戰是入組困難，但其他方面的問題也需要考慮并予以解決。最主要的問題是不可能在大量患者中進行基因組檢測，這與難以獲得腫瘤（轉移）樣本（如骨轉移）以及一些樣品中的癌細胞比例很低有關。可用幾種方法來克服這些限制。首先，當不能獲取組織標本或足夠多的癌組織時，可以應用ctDNA檢測替換活檢。然而，使用這種技術難以量化拷貝數的改變。其次，進行深度測序可以分析低百分比癌細胞的樣品，如MOSCATO試驗引進NGS（1 000×）增加廣泛基因組檢測的可行性［15］。

此外，開發替代技術，以識別驅動突變，包括基因和蛋白表達的檢測，將增加驅動突變患者的數量。例如，在WINTHER試驗中［16］，正在進行基因表達的微陣列分析，并與正常（非癌）組織的基因表達比較，以進行合適的靶向治療。

綜上，結直腸癌中，基因組學所驅動的精準醫學概念是有吸引力的；然而，沒有證據表明它可以改善患者的預后，原因在于來自科學性和實踐的挑戰。在結直腸癌的領域中，最大的問題是除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS，缺乏充分明確的驅動突變［17-20］。開發癌癥相關基因的分類，評估通路蛋白激活的方法，在不遠的將來可以更好地識別這類驅動突變。腫瘤全基因組的表征和活化蛋白網絡將指導聯合治療，以優化療效。最后，實踐中碰見的挑戰是需要解決的問題。臨床研究向個體化醫學，而不是分層醫學的方法轉變，可能改善患者的預后。

最后，改善精準醫學的應用方式也應考慮數據的共享問題。事實上，精準醫學的兩種檢測模式均可以使用。一種是生物標志物公司進行檢測，另一種是公共中心進行免費檢測。例如法國國家癌癥研究所已在學術醫院免費提供所有癌癥患者的基因組信息。

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Precision medicine for colorectal cancer: a big data and micro-progress era

Wei Shaozhong1，Hu Sheng2.1Department of Gastrointestinal Surgery，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430071，China；2Department of Medical Oncology，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430071，China

Hu Sheng，Email: ehusmn@163.com

Precision medicine based on big data is an attractive research field in colorectal cancer.Though the next generation sequencing （NGS） technology has developed rapidly，the challenges from science and practice aspects make the clinical progress fairly slow.In addition to EGFR，MLH1，PIK3CA and KRAS gene abnormalities，no other specific oncogenic driver mutations are found in colorectal cancer，so the biggest challenge is the identification of driver mutations.The development of bioinformatics tools，the application of deep sequencing and circulating tumor DNA （ctDNA） monitoring are helpful to determine rare driver gene mutation rate，assess pathways activation and combine different treatments，which can solve the above problems in future.The change in most candidate genomes is small，which hampers the clinical practice of precision medicine.Individual basket trial or umbrella trial may conquer the limitation.

Colorectal neoplasms； Databases，nucleic Acid； Precision medicine； Micro-progress

2016-05-25）

（本文編輯：姜爭）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.05.001

430071 武漢，湖北省腫瘤醫院胃腸外科1；湖北省腫瘤醫院腫瘤內科2

胡勝，Email：ehusmn@163.com

魏少忠，胡勝.結直腸癌的精準醫學：大數據和微進展的時代［J/CD］.中華結直腸疾病電子雜志，2016，5（5）：370-375.