小麥赤霉病菌對多菌靈和不同殺菌劑敏感性的相關分析

陳宏州，肖婷，許媛，狄華濤，馬圣洲，范婷，楊敬輝

（1江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容212400；2江蘇農林職業技術學院，江蘇句容212400）

?

小麥赤霉病菌對多菌靈和不同殺菌劑敏感性的相關分析

陳宏州1，肖婷1，許媛1，狄華濤1，馬圣洲1，范婷2，楊敬輝1

（1江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容212400；2江蘇農林職業技術學院，江蘇句容212400）

為探明江蘇省小麥赤霉病菌［Gibberella zeae（Schwein.）Petch］對多菌靈的抗藥性和該藥劑與其他殺菌劑的交互抗性，采用區分劑量法檢測了采自江蘇省26個縣（市）的520株小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性，并采用菌絲生長速率法分別檢測了對多菌靈不同敏感性的10個菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟環唑、己唑醇、滅菌唑和咯菌腈等殺菌劑的敏感性。結果表明：江蘇省各縣（市）菌株對多菌靈的抗性頻率差異較大，總抗性頻率為50.58%；通過EC50值相關性分析，小麥赤霉病菌對多菌靈和上述殺菌劑之間不存在交互抗性。江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性頻率較高，迫切需要篩選新的殺菌劑防治小麥赤霉病。

小麥赤霉病菌；多菌靈；抗藥性；交互抗性

0　引言

小麥赤霉病菌［Gibberella zeae（Schwein.）Petch］（無性型為Fusarium graminearum Schwabe），是危害較為嚴重的植物病原真菌之一，在世界范圍內引起小麥和其他谷物的赤霉病［1-2］。小麥赤霉病不僅會導致嚴重的經濟損失，還因產生真菌毒素而嚴重威脅食品安全［3-4］。由于缺乏有效的抗性品種，小麥赤霉病的防治主要依靠殺菌劑。在中國，苯并咪唑類殺菌劑，尤其是多菌靈，一直是防治小麥赤霉病的主導藥劑，用于防治小麥赤霉病已超過30年。

中國自1992年首次發現小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性菌株以來，在江蘇省、上海市和安徽省均檢測到了抗性種群［5-6］。由于出現了抗性種群，1998年以后在江蘇和浙江省，多菌靈對小麥赤霉病的防效急劇下降［6］。隨著抗性種群的發展與蔓延，一旦小麥揚花期遇多雨年份可引起抗藥性病害流行，再噴施多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑可能會導致藥劑防效喪失。近年來，小麥赤霉病導致中國每年有超過500萬hm2（大約20%）的小麥種植區域發生顯著的減產，從2008至2012年在長江中下游地區發生了1次嚴重和2次中等的病害流行［7］，并且逐步蔓延到中國北方的淮河和黃河流域［8］。為治理小麥赤霉病菌的抗藥性，中國許多研究人員篩選或研發新的殺菌劑如咪酰胺［6］、戊唑醇［9］、福美雙［10］、氰烯菌酯［11］、申嗪霉素［12］和氟啶胺［13］等用于防治小麥赤霉病。目前，中國登記用于防治小麥赤霉病的殺菌劑產品有將近300個，但超過半數產品有效成分為多菌靈或甲基硫菌靈，其他產品有效成分主要為咪酰胺、福美雙、戊唑醇和氰烯菌酯等幾種藥劑，抗性治理的形勢仍然十分嚴峻。

為探明江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性現狀，以及對其他甲氧基丙烯酸酯類（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類（咯菌腈）等3類8種殺菌劑的交互抗性，筆者從江蘇省的26個縣（市）采集了520株小麥赤霉病菌，然后檢測了小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性以及對上述8種殺菌劑的敏感性，以期為小麥赤霉病的防治和抗藥性的治理提供依據。

1　材料與方法

1.1供試培養基

馬鈴薯培養基（PDA）［14］，用于小麥赤霉病菌的單孢分離、保存以及室內藥劑試驗。

1.2供試菌株

2015年5月27—29日，分別從江蘇省句容市等26個縣（市）采集小麥病穗樣品，每田塊采1～2個病樣，每個病樣分別存放于紙質樣品袋內，防止交叉污染。采用平板稀釋畫線分離法對病樣進行小麥赤霉病菌的單孢分離［15］，經單孢分離后將菌株保存備用，菌株的采集地點見表1。

表1　江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性檢測

1.3供試藥劑

97.09%多菌靈（Carbendazim），上海升聯化工有限公司；96.6%嘧菌酯（Azoxystrobin），江蘇耘農化工有限公司；95%吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin），德國巴斯夫股份有限公司；97%肟菌酯（Trifloxystrobin），江蘇耕耘化學有限公司；97%唑胺菌酯（pyrametostrobin），沈陽化工研究院有限公司；97%氟環唑（Epoxiconazole），北京綠色農華植保科技有限公司；95.9%己唑醇（Hexaconazole），江蘇耘農化工有限公司；96%滅菌唑（Triticonazole），陜西美邦農藥有限公司；98%咯菌腈（Fludioxonil），上海開榮化工科技有限公司。將97.09%多菌靈用適量0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，其他藥劑分別用適量丙酮溶解，然后用無菌水定容至所需體積，并加入5%的吐溫-80作為乳化劑，8種供試殺菌劑均配制成10000 μg/mL的母液置于冰箱中冷藏備用。

99%水楊肟酸（Salicylhydroxamic acid，簡寫為SHAM），美國Acros Organics公司，用適量甲醇溶解，配制成50000 μg/mL的母液置于冰箱中冷藏備用。

1.4小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性檢測

采用區分劑量法，以10 μg/mL多菌靈為區分劑量，以不加藥劑為對照。將保存的供試菌株移植到PDA平皿中，在25℃下活化3天，然后在菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并分別移植到上述含藥劑和對照平皿中，25℃下培養2天，每個處理重復3次。供試菌株能在含10 μg/mL多菌靈的平皿上生長，則鑒定為抗性菌株（R），不能生長的為敏感菌株（S）［6］。

1.5不同殺菌劑對小麥赤霉病菌的毒力檢測

在預試驗基礎上，采用菌絲生長速率法［17］，分別將甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類殺菌劑（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類殺菌劑（咯菌腈）的母液，依次稀釋至一定濃度，再將1 mL藥液與9 mL PDA培養基在培養皿內混勻，制成含系列梯度濃度藥劑的PDA培養基。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類殺菌劑（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類殺菌劑（咯菌腈）的系列梯度濃度分別設計為50～0.78125 μg/mL、10～0.15625 μg/mL和5～0.078125 μg/mL，均為2倍遞減稀釋的7個不同濃度梯度的含藥PDA培養基，采用無菌水作對照，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的處理與對照中均加入100 μg/mL的旁路氧化酶抑制劑SHAM，各處理重復4次。將采自江蘇省洪澤縣高良澗鎮，對多菌靈敏感菌株1-5（S）和抗性菌株1-1（R）分別移植到PDA平皿中，在25℃下活化3天，然后在菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并分別移植到上述2倍遞減稀釋配制的含藥和對照的平皿中，25℃下培養3天后采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑平均值，并按照公式（1）計算菌絲生長平均抑制率。

采用DPSv7.05版數據處理系統，分別計算嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟環唑、己唑醇、滅菌唑和咯菌腈等8種殺菌劑對供試小麥赤霉病菌菌絲生長抑制的毒力回歸方程、EC50及其95%置信限。

1.6多菌靈與不同作用機制殺菌劑的交互抗性檢測

在預試驗基礎上，采用菌絲生長速率法，分別檢測10株對多菌靈不同敏感程度的菌株（5株敏感，5株抗性）對苯并咪唑類殺菌劑（多菌靈）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類殺菌劑（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類殺菌劑（咯菌腈）等4類9種殺菌劑的敏感性。方法同1.5，其中多菌靈的系列梯度濃度設計與三唑類殺菌劑相同。采用Excel軟件進行多菌靈和上述殺菌劑之間對不同菌株EC50值的相關性分析并制圖。

2　結果與分析

2.1小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性

抗藥性檢測結果得出，2015年5月采自江蘇省句容市等26個縣（市）的小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性頻率最低為15.00%，最高達89.29%，不同地區菌株抗性頻率差異較大，總抗性頻率達50.58%（表1）。這表明，江蘇省小麥赤霉病抗藥性病原群體在多菌靈選擇壓下發展迅速，抗性頻率已上升到較高水平，一旦遇到病害流行并繼續用多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑防治，就可能會對小麥赤霉病失去控制。

2.2不同殺菌劑對小麥赤霉病菌的敏感性

分別以對多菌靈敏感菌株1-5（S）和抗性菌株1-1（R）為靶標，比較不同殺菌劑對小麥赤霉病菌的毒力。以敏感菌株1-5（S）為靶標時，8種殺菌劑的毒力由弱到強依次為嘧菌酯、唑胺菌酯、肟菌酯、吡唑醚菌酯、己唑醇、氟環唑、滅菌唑和咯菌腈；以抗性菌株1-1（R）為靶標時，8種殺菌劑的毒力由弱到強依次為嘧菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、吡唑醚菌酯、己唑醇、氟環唑、滅菌唑和咯菌腈（表2）。這表明，供試的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制活性整體相對較低，其中吡唑醚菌酯的抑制活性最強；三唑類殺菌劑對病菌菌絲生長的抑制活性居中，其中滅菌唑的抑制活性最強；吡咯類殺菌劑（咯菌腈）對病菌菌絲生長的抑制活性最強。

2.3多菌靈與不同作用機制殺菌劑的交互抗性

以10株對多菌靈不同敏感程度的菌株（5株敏感，5株抗性）為靶標，分別檢測對苯并咪唑類殺菌劑（多菌靈）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類殺菌劑（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類殺菌劑（咯菌腈）的敏感性。通過EC50值線性回歸分析得出，多菌靈與嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟環唑、己唑醇、滅菌唑和咯菌腈的決定系數分別為0.1051、0.0061、0.0818、0.0092、0.0261、0.0832、0.1065和0.0468，在P=0.05水平上均不顯著（圖1）。這表明，多菌靈與上述8種殺菌劑之間不存在交互抗性。

表2　不同殺菌劑對小麥赤霉病菌的室內毒力

圖1　小麥赤霉病菌對多菌靈與不同殺菌劑敏感性的相關分析

3　討論

相關的研究表明，江蘇、浙江和上海等地小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性已普遍發生，不同年份和地區的抗性菌株頻率差異較大，在藥劑選擇壓力下，抗性菌株頻率呈上升趨勢［6，16-17］。本研究采用區分劑量法檢測了2015年江蘇省26個縣（市）的520株小麥赤霉病對多菌靈的抗藥性，結果表明不同地區間菌株抗性頻率差異較大，最高達89.29%，全省菌株抗性頻率為50.58%。由于在江蘇省各地區取樣的樣本偏少，可能沒有完全反映江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性現狀。根據筆者的研究結果并結合各地區小麥赤霉病的防治現況，江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性已整體發展到了更高水平，在部分地區噴施多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑防治小麥赤霉病意義不大。

當前，篩選防治小麥赤霉病的替代殺菌劑，對保障小麥高產和穩產具有重要意義。本研究發現，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑類殺菌劑（氟環唑、己唑醇和滅菌唑）和吡咯類殺菌劑（咯菌腈）等3類8種殺菌劑對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制活性均較強，其中滅菌唑和咯菌腈的抑菌活性尤為突出。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是繼三唑類殺菌劑之后極具發展潛力和市場活力的新型殺菌劑。該類殺菌劑，通過阻止細胞色素bcl復合物中Qo位點的電子傳遞，阻止ATP合成，從而干擾呼吸抑制真菌生長；同時還能提高產量，延緩植物衰老，這是其他類殺菌劑所不及的［18-19］。本研究中，該類殺菌劑對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制活性與相關的報道有較大的差異［20］，這可能是由于本研究進行敏感性檢測時加入了旁路氧化酶抑制劑SHAM，能更好的反應出該類藥劑在田間對病原菌的抑制活性［21］。唑胺菌酯，是該類殺菌劑中由沈陽化工研究院自主研發的殺菌劑，內吸傳導性優異，兼具保護和治療效果［22］，對小麥赤霉病菌抑制活性也較強。近年來，三唑類殺菌劑戊唑醇在治理小麥赤霉病抗藥性中發揮了較大的作用，本研究發現氟環唑等其他三唑類殺菌劑也具備較好的應用潛力。咯菌腈為吡咯類殺菌劑，作用機理獨特，殺菌譜廣，毒性低［23］，在供試的8種殺菌劑中對小麥赤霉病菌的毒力最強。

通過EC50值相關性分析，小麥赤霉病菌對多菌靈與嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟環唑、己唑醇、滅菌唑以及咯菌腈的敏感性均沒有顯著相關性，這表明小麥赤霉病菌對多菌靈與供試的8種殺菌劑之間均不存在交互抗性。可見，供試的3類8種殺菌劑在防治小麥赤霉病中均具有一定的應用前景。本研究僅在離體條件下進行了殺菌劑試驗，相關殺菌劑的田間藥效還有待進一步驗證，同時在田間應用中要科學合理用藥，以延緩小麥赤霉病菌抗藥性的產生與蔓延。

［1］Maier F J，Malz S，Losch A P，et al.Development of a highly efficient gene targeting system for Fusarium graminearum using the disruption of a polyketide synthase gene as a visible marker［J］. FEMS Yeast Res.，2005，5:653-662.

［2］Proctor R H，Hohn T M，McCormick S P.Restoration of wildtype virulence to Tri5 disruption mutants of Gibberella zeae via gene reversion and mutant complementation［J］.Microbiology，1997，143: 2583-2591.

［3］Atanassov Z，Nakamura C，Mori N，et al.Mycotoxin production and pathogenicity of Fusarium species and wheat resistance to Fusarium head blight［J］.Can J Bot.，1994，72:161-167.

［4］Chen C J，Wang J X，Luo Q Q，et al.Characterizationand fitness of carbendazim-resistant strains of Fusarium graminearum（wheat scab）［J］.Pest Manag Sci，2007，63:1201-1207.

［5］Liu X，Yin Y N，Wu J B，et al.Identification and characterization of carbendazim-resistant isolates of Gibberella zeae［J］.Plant Dis.，2010，94:1137-1142.

［6］王建新，周明國，陸悅健，等.小麥赤霉病菌抗藥性群體動態及其治理藥劑［J］.南京農業大學學報，2002，25（1）:43-47.

［7］Liu Y，Chen X，Jiang J H，et al.Detection and dynamics of different carbendazim-resistance conferringβ-tubulin variants of Gibberella zeae collected from infected wheat heads and rice stubble in China［J］.Pest manag Sci.，2014，70:1228-1236.

［8］Qu B，Li H P，Zhang J B，et al.Comparison of genetic diversity and pathogenicity of Fusarium head blight pathogens from China and Europe by SSCP and seedling assays on wheat［J］.Plant Pathol，2008，57:642-651.

［9］韓青梅，康振生，黃麗麗，等.戊唑醇對小麥赤霉菌侵染影響的細胞學研究［J］.植物保護學報，2005，32（1）:57-62.

［10］畢秋艷，馬志強，張小風，等.福美雙和戊唑醇增效與拮抗組合對小麥赤霉病菌細胞膜透性及內含物滲漏的影響［J］.中國農學通報，2009，25（20）:222-227.

［11］刁亞梅，倪玨萍，馬亞芳，等.創制殺菌劑氰烯菌酯的應用研究［J］.植物保護，2007，33（4）:121-123.

［12］侯昌亮，艾爽，姚安慶，等.5種殺菌劑對小麥赤霉病菌的室內毒力測定［J］.長江大學學報:自然科學版，2012，9（12）:1-2.

［13］侯昌亮，胡寒哲，艾爽，等.11種殺菌劑對小麥赤霉病菌的抑制作用［J］.湖北農業科學，2014，53（17）:4066-4068.

［14］趙斌，何紹江.微生物學實驗［M］.北京:科學出版社，2002:251.

［15］張昊，張爭，許景升，等.一種簡單快速的赤霉病菌單孢分離方法—平板稀釋畫線分離法［J］.植物保護，2008，34（6）:134-136.

［16］石志琦，史建榮，陳懷谷，等.小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性研究［J］.農藥學學報，2000，2（4）:22-27.

［17］王建新，周明國.小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性監測技術研究［J］.植物保護學報，2002，29（1）:73-77.

［18］Xiao K H，Gregory E，Sany R，et al.Effect Of famoxadone on photoinduced electron transfer between the Iron-Sulfur center and cytochrome c1 in the cytochrome bcl complex［J］.The Journal of Biological Chemistry，2003，278:11419-11426.

［19］Lothar E，Byron Q，Li Y F，et al.Crystallographic studies of quinol oxidation site inhibitors:a modified classificadon of inhibitors for the cytochrome bcl complex［J］.Journal of Molecular Biology，2004，341:281-302.

［20］翟平平，劉友超，姚安慶.小麥赤霉病殺菌劑室內篩選試驗［J］.長江大學學報:自然科學版，2012，9（3）:1-2，14.

［21］金麗華，陳長軍，王建新，等.嘧菌酯及SHAM對4種植物病原真菌的活性和作用方式研究［J］.中國農業科學，2007，40（10）:2206-2213.

［22］楊瑞秀，司乃國.唑胺菌酯（SYP-4155）作用特性研究.//周明國，陳長軍.中國植物病害化學防治研究（第6卷）［M］.北京:中國農業科學技術出版社，2008:25-28.

［23］劉穎超，張金林，龐民好，等.咯菌腈對草莓灰霉病Botrytis cinerea的毒力及防效研究初報［J］.農藥學學報，2002，4（3）:94-96.

Sensibility Correlation Analysis of Gibberella zeae（Schwein.）Petch to Carbendazim and Other Fungicides

Chen Hongzhou1，Xiao Ting1，Xu Yuan1，Di Huatao1，Ma Shengzhou1，Fan Ting2，Yang Jinghui1
（1Zhenjiang Institute of Agricultural Science in Hilly Area of Jiangsu Province，Jurong 212400，Jiangsu，China；2Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry，Jurong 212400，Jiangsu，China）

In order to investigate the resistance of Gibberella zeae（Schwein.）Petch to carbendazim and the cross resistance to carbendazim and other fungicides，the drug resistance of 520 isolates of G.zeae（Schwein.）Petch collected from 26 counties（cities）in Jiangsu Province were detected by the method of distinguishing dosage method，and then 10 isolates with different sensitivities to carbendazim were used to study the cross resistance to azoxystrobin，pyraclostrobin，trifloxystrobin，pyrametostrobin，epoxiconazole，hexaconazole，triticonazol and fludioxonil by the method of mycelium growth rate method.The results showed that the resistance frequency of G.zeae（Schwein.）Petch of different counties（cities）in Jiangsu was different，and the total resistance frequency was 50.58%；correlation analysis of EC50showed that there was no cross resistance between carbendazim and other fungicides.These results suggested that G.zeae（Schwein.）Petch in Jiangsu had relatively high resistance frequency to carbendazim，and it was urgent to screen new fungicide to control fusarium head blight.

Gibberella zeae；Carbendazim；Resistance；Cross Resistance

S435.121

A論文編號：cjas16040033

江蘇省農業科技自主創新資金項目“稻麥兩熟制高產平衡技術方案”［CX（15）1002］；鎮江市農業科技支撐項目“小麥赤霉病抗性檢測與防控技術研究”（NY2013003）；“市域主要農作物病原菌抗藥性檢測與監測”（NY2015019）。

陳宏州，男，1984年出生，廣西宜州人，助理研究員，碩士，主要從事農作物病害抗藥性檢測與治理研究。通信地址：212400江蘇省句容市弘景路1號江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，Tel：0511-80978079，E-mail：hongzc_2006@126.com。

楊敬輝，男，1973年出生，云南麗江人，研究員，博士，主要從事植物保護研究。通信地址：212400江蘇省句容市弘景路1號江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，Tel：0511-80978079，E-mail：yjhnn32@126.com。

2016-04-29，

2016-07-03。