二甲雙胍聯合compound C對小鼠4T1乳腺癌細胞增殖和細胞周期蛋白D1表達的影響

馬宇光, 張寅斌, 梁　亮, 趙　陽, 焦菊鳳, 昝　瑛

(西安交通大學第二附屬醫院 腫瘤科, 陜西 西安, 710000)

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論著

二甲雙胍聯合compound C對小鼠4T1乳腺癌細胞增殖和細胞周期蛋白D1表達的影響

馬宇光, 張寅斌, 梁亮, 趙陽, 焦菊鳳, 昝瑛

(西安交通大學第二附屬醫院 腫瘤科, 陜西 西安, 710000)

目的探討二甲雙胍及單磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制劑(compound C)對小鼠乳腺癌4T1細胞增殖及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達的影響。方法選取小鼠乳腺癌4T1細胞體外培養，分別以完全培養基為空白組, 4T1細胞為對照組，在細胞培養中分別加入濃度為2.5、5、10、20、40 mmol/L的二甲雙胍為實驗組1～5, 以10 mmol/L的二甲雙胍聯合20 μmol/L compound C的為實驗組6, 20 μmol/L compound C的為實驗組7。檢測各組細胞株增殖情況及細胞內cyclin D1的表達。結果 二甲雙胍作用24、48 h時，實驗組1與對照組存活率無顯著差異(P>0.05), 實驗組2～5細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05); 72 h時，實驗組1～5存活率均顯著低于對照組(P<0.05); 實驗組3、4、5在24、48、72 h時，各組cyclin D1的相對表達量均顯著低于對照組(P<0.05); 各組48 h時cyclin D1的相對表達量顯著低于24 h時(P<0.05); 72 h時cyclin D1的相對表達量顯著低于各組48 h時(P<0.05); 實驗組3 cyclin D1的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05), 實驗組6、7在各時間點與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。結論二甲雙胍能抑制小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖，而compound C對其有拮抗作用；二甲雙胍對小鼠乳腺癌4T1細胞cyclin D1蛋白表達有下調作用。

乳腺癌; 4T1細胞; 二甲雙胍; compound C; 細胞增殖; 細胞周期蛋白D1

全球乳腺癌發病率一直呈上升趨勢，中國不是乳腺癌的高發國家，但近年來發病率的增長速度高出高發國1～2%左右[1]。據國家癌癥中心和衛生部疾病預防控制局公布的乳腺癌發病數據，全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率城市為34.3/10萬，農村為17.0/10萬[2]。乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，乳腺癌細胞之間黏連松散、容易脫落，導致癌細胞游離，隨血液或淋巴系統而擴散、轉移，危及生命[3]。二甲雙胍最早作為胰島素增敏劑用于治療2型糖尿病，近年來研究發現其可以抑制腫瘤生長、降低惡性腫瘤發病風險[4]。本研究從細胞層面入手，檢測了二甲雙胍及單磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制劑(compound C)對小鼠乳腺癌4T1細胞增殖及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達的影響，為動物實驗及臨床研究提供一定依據。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

小鼠乳腺癌4T1細胞購于中國科學院上海細胞庫; RPMI-1640培養基、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸二甲雙胍、cyclin D1抗體、compound C干粉、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液、電化學(ECL)發光液均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2實驗方法

常規細胞復蘇、培養，傳代3次后取對數生長期細胞，接種于96孔板中，密度為1×103/孔，每組6孔。實驗共8組。空白組：完全培養基，對照組：未經處理的4T1細胞；實驗組1～5: 在細胞培養基中分別加入濃度為2.5、5、10、20、40 mmol/L的二甲雙胍；實驗組6：加10 mmol/L的二甲雙胍聯合20 μmol/L compound C(compound C給藥24 h后加入二甲雙胍)；實驗組7：加20 μmol/L compound C。實驗重復3次。

1.3檢測方法

1.3.1CCK-8檢測細胞增殖能力：分別于加藥24、48、72 h后取出，各孔加CCK-8溶液10 μL, 于培養箱內繼續培養1 h后進行檢測，酶標儀450 nm波長處測定各組吸光度值，重復3次。存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.2Western Blot檢測細胞周期蛋白D1表達量：細胞收集后提取總蛋白，測定蛋白濃度，調整各樣品蛋白濃度至相當，按一定比例(蛋白樣品體積：蛋白上樣緩沖液體積為4: 1)加入蛋白上樣緩沖液, 100 ℃加熱樣品使蛋白變性5 min, 離心20 s, 冷卻后置于-20 ℃備用。每孔加入1 μL的蛋白樣品，同時加入10 μL彩色預染蛋白分子量標準Marker, 進行SDS-PAGE電泳，于60 V電壓恒定跑膠30 min, 調電壓至80 V, 穩壓電泳90 min, 待條帶接近底部邊緣時終止。轉膜完成后取適量麗春紅染液中染色5 min, 洗去浮色，判斷蛋白轉移情況。采用TBST緩沖液清洗后加5%的脫脂奶粉封閉1～2 h, 隨后TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min; 洗完膜后孵育一抗和二抗，最后采用ECL發光試劑盒，完成X片曝光、顯影及定影, Western Blot均在相同條件下重復3次。Cyclin D1的相對定量=Cyclin D1蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶的灰度值。

1.4統計學方法

2　結　果

2.1二甲雙胍及compound C對小鼠乳腺癌4T1細胞存活率的影響

二甲雙胍作用24、48 h時，實驗組1與對照組細胞存活率無顯著差異(P>0.05), 實驗組2～5細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05); 72 h時，實驗組1～5細胞存活率均顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2二甲雙胍聯合compound C對小鼠乳腺癌4T1細胞存活率的影響

由于實驗組3在24、48及72 h時細胞存活率均在50%左右，故后續實驗選用10 mmol/L的濃度與compound C聯合作用。實驗組3在24、48、72 h時細胞存活率均低于對照組(P<0.05), 實驗組6、7在24、48、72 h時細胞存活率與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表1　不同濃度二甲雙胍作用不同時間后各組小鼠乳腺癌 4T1細胞的存活率比較

與對照組比較, *P<0.05; 與24 h比較, #P<0.05。

表2　二甲雙胍聯合compound C對小鼠乳腺癌4T1細胞 的存活率比較±s)

與對照組比較, *P<0.05。

2.3二甲雙胍及compound C對小鼠4T1細胞周期蛋白D1的表達影響

實驗組2、3、4在24、48、72 h時cyclin D1的相對表達量均顯著低于對照組(P<0.05); 各組2、3、4在48 h時cyclin D1的相對表達量顯著低于24 h時(P<0.05); 實驗組2、3、4在72 h時cyclin D1的相對表達量顯著低于各組48 h時(P<0.05)。見表3。

表3　不同濃度二甲雙胍處理細胞后cyclin D1的 表達情況

與對照組比較, *P<0.05; 與24 h比較, #P<0.05;

與48 h比較, △P<0.05。

2.4二甲雙胍聯合compound C處理細胞后cyclin D1的表達情況

實驗組3 cyclin D1的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05); 實驗組6、7在各時間點與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4　二甲雙胍聯合compound C處理細胞后cyclin D1 的表達情況

與對照組比較, *P<0.05。

3　討　論

二甲雙胍對腫瘤細胞增殖間接抑制作用主要通過減少循環中的胰島素水平，通過影響胰島素和胰島素樣生長因子-1通路間接抑制腫瘤細胞的增殖[5]; 二甲雙胍通過激活單磷酸腺苷依賴蛋白激酶(AMPK)通路來實現對腫瘤細胞增殖的直接抑制作用[6], 降低微管蛋白、組蛋白等細胞分裂相關基因的表達，從而抑制細胞的分裂和增殖[7-8]; 另外，二甲雙胍還能提高T細胞記憶力，當免疫系統遭到病毒感染或癌細胞攻擊的時候能增強反應力度，降低惡性腫瘤的發生率[9]。惡性腫瘤細胞無限增殖主要是由于細胞周期調節失控，而細胞分裂周期的關鍵在于G1/S、G2/M期之間的轉換[10]。細胞G1期調控的關鍵因素為cyclin D1, 而當cyclin D1過表達時，可縮短細胞G1期，提前進入S期，使細胞增生異常[11-12], 因此cyclin D1低表達者的生存率高于cyclin D1過表達者，而AMPK通過使cyclin D1 mRNA丟失從而使其蛋白表達量下調，從而抑制細胞增殖。

本研究從細胞層面著手，應用不同濃度二甲雙胍對小鼠乳腺癌4T1細胞進行體外培養，分別于24、48、72 h時經CCK-8法測定細胞存活率，結果顯示隨著二甲雙胍濃度的增加和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制更明顯，二甲雙胍對乳腺癌細胞的增殖抑制作用表現出了良好的濃度依賴性且與時間也呈較好的依賴性。單用compound C時，細胞存活率與正常對照組無顯著差異，提示compound C對細胞增殖無抑制作用；而二甲雙胍與compound C聯合使用時，其存活率與對照組也無統計學差異，提示compound C與二甲雙胍有拮抗作用，與杜洪泉等[13]研究結果一致。

Western bolt實驗結果顯示，隨二甲雙胍濃度增加, cyclin D1表達量明顯下調，從而抑制細胞增殖，與CCK-8檢測結果吻合，提示二甲雙胍對

4T1細胞的增殖有抑制作用；而compound C作為AMPK抑制劑，在與二甲雙胍聯合應用時, cyclin D1表達量與對照組無顯著差異，提示其阻礙了二甲雙胍激活AMPK通路，與Cai等[14]研究結果一致。

本研究表明二甲雙胍對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖有抑制作用，而其作用機制可能是通過激活AMPK通路，下調cyclin D1表達量來實現的。

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Influence of metformin combined with compound C on the proliferation of breast cancer 4T1 cells and expression of cyclin D1 in mice

MA Yuguang, ZHANG Yinbin, LIANG Liang, ZHAO Yang, JIAO Jufeng, ZAN Ying

(DepartmentofOncology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi, 710000)

ObjectiveTo investigate the influence of metformin combined with adenosine monophosphate-activated protein kinase inhibitors (compound C) on the proliferation of breast cancer 4T1 cells and expression of cyclin D1 in mice. MethodsBreast cancer 4T1 cells were selected and cultured in vitro. The complete medium was considered as blank group, 4T1 cells as control group, addition of metformin 2.5, 5, 10, 20 and 40 mmol/L to the cell culture respectively as experimental groups 1～5, metformin (10 mmol/L) combined with compound C (20 μmol/L) as experimental group 6, and compound C 20 μmol/L as experimental group 7. The proliferation of cell lines and expression of intracellular cyclin D1 were respectively detected in each group. ResultsWhen metformin functioned for 24 and 48 h, no significant difference was shown between experimental group 1 and control group regarding the survival rate (P>0.05), but the cell survival rates of experimental groups 2～5 were significantly lower than those of control group (P<0.05). At the time of 72 h, the survival rates of experimental groups 1～5 were all markedly lower than those of control group (P<0.05). At the time of 24, 48 and 72 h, the relative expression quantities of cyclin D1 in experimental groups 1～3 were all significantly lower than those in control group (P<0.05). In each group, the relative expression quantity of cyclin D1 was lower at 48 h than at 24 h (P<0.05), and that was also lower at 72 h than at 48 h (P<0.05). Additionally, the relative expression quantity of cyclin D1 was significantly lower in experimental group 3 than in control group (P<0.05), but nosignificant difference was shown by comparing experimental groups 6 and 7 with control group at each time points (P>0.05). ConclusionMetformin can inhibit the proliferation of breast cancer 4T1 cells in mice,but this effect can be resisted by compound C. Metformin can down-regulate cyclin D1 expression of breast cancer 4T1 cells in mice.

breast cancer; 4T1 cells; metformin; compound C; cell proliferation; cyclin D1

2016-03-23

R 737.9

A

1672-2353(2016)17-001-03

10.7619/jcmp.201617001