水通道蛋白1在膽囊黏膜中的表達(dá)及臨床意義

高　源, 朱春富, 張京平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

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水通道蛋白1在膽囊黏膜中的表達(dá)及臨床意義

高源, 朱春富, 張京平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

水通道蛋白1; 膽囊黏膜; 表達(dá)

膽囊炎是肝膽外科常見(jiàn)疾病，其主要病因?yàn)槟懩医Y(jié)石形成。膽囊炎主要病理表現(xiàn)為膽囊壁水腫，膽囊內(nèi)膽汁淤積或結(jié)石形成[1]。水通道蛋白-1(AQP-1)主要參與黏膜內(nèi)外水分的轉(zhuǎn)運(yùn)，有報(bào)道[2]稱其表達(dá)同炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。本研究探討AQP-1與膽囊結(jié)石的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年10—12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院普外科接受膽囊手術(shù)切除的患者64例，其中膽囊結(jié)石45例，膽囊息肉19例。45例膽囊結(jié)石中，急性膽囊炎20例，慢性膽囊炎25例。男21例，女43例，平均年齡(39.15±14.65)歲。

1.2方法

免疫組化: 6 μm切片，石蠟固定標(biāo)本，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。經(jīng)0.01 mol/L檸檬酸, 100℃下10 min抗原修復(fù)。3%的雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，一抗(1∶500 稀釋, Abcam 公司，美國(guó))4℃ 孵育過(guò)夜, PV9000 室溫孵育, DAB顯色，蘇木素復(fù)染。5%胎牛血清代替一抗為陰性對(duì)照。

蛋白提取及 Western blot 檢測(cè)：參照蛋白提取試劑盒(碧云天公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。40 μg蛋白上樣后 80 V電泳，蛋白彌散后改為100 V繼續(xù)電泳，約 2 h。250 mA, 恒流濕轉(zhuǎn)，65 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后 5%BSA 封閉 2 h, 加入一抗(Abcam公司，美國(guó))后4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜3遍，每次15 min。 然后加入二抗后37℃恒溫箱孵育, TBST 洗膜 3 遍，每次15min。顯影液顯影，凝膠成像儀獲取圖像。

PT-PCR: 總 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(大連寶生物公司)。反轉(zhuǎn)錄PCR引物由英濰捷基公司合成。AQP-1上游引物: 5-CTGTGGGATTAACCCTGCTC-3; 下游引物: 5- GGTCTGTGAGGTCACTGCTG-3; GAPDH 上游引物: 5- ACAACTTTGGCATTGTGGAA -3; 下游引物: 5- GATGCAGGGATGATGTTCTG -3。由Labnet PCR儀完成擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 95℃ 15 s 預(yù)變性，PCR 反應(yīng), 60℃ 20 s, 60℃ 20 s, 共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用相對(duì)定量法分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，各組間AQP-1及AQP-8表達(dá)陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。 Western blot 圖片用Image-J測(cè)灰度值; Western blot結(jié)果和RT-PCR結(jié)果均采用 Graphpad Prism5軟件，行單因素方差分析檢驗(yàn)作圖。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

免疫組化顯示，有結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)陽(yáng)性率為84%(38/45), 而在單純膽囊息肉的膽囊黏膜中AQP-1未見(jiàn)明顯表達(dá)。進(jìn)一步Western Blot檢驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊(圖1)。針對(duì)AQP-1的mRNA檢測(cè)同樣存在上述表達(dá)差異(圖2)。

3　討　論

有報(bào)道[2-5]稱AQP-1同時(shí)還表達(dá)于膽囊、多種腫瘤組織中，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，其主要機(jī)制為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)淋巴、血管等。Verkman等[6-10]通過(guò)對(duì)正常小鼠膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)的研究闡述AQP-1廣泛存在于小鼠黏膜層，其主要作用是向膽囊腔內(nèi)分泌水分，然而這樣的水分未改變膽汁成分，故認(rèn)為AQP-1對(duì)膽囊結(jié)石形成無(wú)意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)正常狀態(tài)、結(jié)石形成狀態(tài)下膽囊黏膜內(nèi)AQP-1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示結(jié)石形成的膽囊黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊組，且慢性炎癥組同急性炎癥膽囊黏膜組之間無(wú)顯著差異。針對(duì)AQP-1的mRNA表達(dá)測(cè)定同樣存在上述表達(dá)差異。

A. 在膽囊結(jié)石的膽囊黏膜表面表達(dá)陽(yáng)性; B. 在膽囊息肉的膽囊黏膜表達(dá)陰性。圖1　AQP-1及AQP-8在不同狀態(tài)膽囊黏膜中的表達(dá)差異

AQP-1、AQP-8同時(shí)表達(dá)于膽囊黏膜內(nèi)[11-12]，AQP-1主要承載水的分泌功能，而AQP-8則充當(dāng)水分的重吸收功能。AQP-1在結(jié)石性膽囊黏膜中到表達(dá)增多的可能機(jī)制如下: ① 當(dāng)膽汁逐步黏稠層積，膽汁濃度增加，誘導(dǎo)黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)水分分泌，以達(dá)到稀釋膽汁，減緩結(jié)石形成。② AQP-1表達(dá)增強(qiáng)、促進(jìn)水分的分泌，使膽囊腫脹，膽囊收縮功能下降，致使膽汁層積，進(jìn)而演變?yōu)榻Y(jié)石形成。上述可能機(jī)制均表明AQP-1同膽囊結(jié)石形成存在一定的聯(lián)系。

[1]Van Erpecum K J. Pathogenesis of cholesterol and pigment gallstones: an update[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2011, 35(4): 281-287.

[2]Verkman AS. Aquaporins at a glance[J]. J Cell Sci, 2011, 124(Pt 13): 2107-2112.

[3]Wu Z, Li S, Liu J, et al. RNAi-mediated silencing of AQP1 expression inhibited the proliferation, invasion and tumor genesis of osteosarcoma cells[J]. Cancer Biol Ther, 2015: 1-9.

[4]Wei X, Dong J. Aquaporin 1 promotes the proliferation and migration of lung cancer cell in vitro[J]. Oncol Rep, 2015, 34(3): 1440-1448.

[5]Tan M, Shao C, Bishop J A, et al. Aquaporin-1 promoter hypermethylation is associated with improved prognosis in salivary gland adenoid cystic carcinoma[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2014, 150(5): 801-807.

[6]Li L, Zhang H, Ma T, et al. Very high aquaporin-1 facilitated water permeability in mouse gallbladder[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 296(4): G816-G822.

[7]Calamita G, Ferri D, Bazzini C, et al. Expression and subcellular localization of the AQP8 and AQP1 water channels in the mouse gall-bladder epithelium[J]. Biol Cell, 2005, 97(6): 415-423.

[8]劉笑玎, 原銘貞, 王司儀, 等. 水通道蛋白1、3、4和5與急性肺損傷關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2014, 40(5): 1119-1122.

[9]王從軍, 王紅, 王曼. 先天性腎積水患兒尿液水通道蛋白1表達(dá)的意義[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2012, 27(11): 832-834.

[10]劉多謀, 黃鶴光, 周武漢, 等. 白細(xì)胞介素-1β對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及水通道蛋白-1的影響[J]. 中華肝膽外科雜志, 2014, 20(2): 123-125.

[11]張霖, 王錦權(quán). 水通道蛋白在急性肝損傷中的作用的研究進(jìn)展[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 92(16): 1148-1150.

[12]王吉. 水通道蛋白1在長(zhǎng)期高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的小鼠腹膜纖維化中的作用[D]. 吉林大學(xué), 2016.

2016-04-15

江蘇省常州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CJ20140037)

張京平, E-mail: zjpcz2016@126.com

R 575.6

A

1672-2353(2016)17-193-02

10.7619/jcmp.201617074