多重PCR檢測在兒童肺炎細菌性病原中的臨床應用

劉妙娥　馮慧艷　趙尊

[摘要]目的 探討多重PCR檢測在兒童肺炎細菌性病原中的臨床應用價值。方法 選取2015年1～7月在我院就診的300例肺炎患兒，收集患兒呼吸道分泌物，進行細菌培養并提取DNA，利用多重PCR擴增14種呼吸道病原菌靶基因，統計分析多重PCR檢測兒童肺炎細菌性病原敏感性和特異性。結果 從300例標本中，細菌培養出184株病原菌，陽性率為61.33%（184/300）。經多重PCR擴增檢測118例樣本呈陽性，陽性率為39.3%（118/300）。對14種病原菌多重PCR的敏感性為51.6%，特異性為68.6%，符合率為58.9%。多重PCR對SPN檢出率（15.7%，47/300）高于培養（5.7%，17/300）（P<0.05）；聯合檢測細菌性病原檢出率為80.67%（242/300），聯合檢測顯著提高金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的檢出率。結論 多重PCR技術對肺炎鏈球菌檢測的敏感性較高，聯合檢測能提高兒童肺炎細菌性病原檢出率。

[關鍵詞]多重PCR；兒童肺炎；細菌性病原；臨床運用

[中圖分類號]R725.6 [文獻標識碼]B [文章編號]2095-0616（2016）05-169-04

在兒童肺炎的診治中，明確病原很重要。近些年隨著抗菌素的早期、廣泛應用，使細菌培養的陽性率大大降低，給細菌性肺炎的病原學診斷增加了難度。目前臨床中常用的細菌培養、免疫熒光、單PCR技術等檢測方法，一般往往只能檢測出一種或一類病原，無法檢測出其他病原或混合感染，因此需要尋找一個多重檢測或聯合檢測的方法來加強病原學診斷，指導臨床工作和用藥。本研究采用多重PCR技術檢測細菌性肺炎臨床標本，比較多重PCR、細菌培養、單PCR對各種病原的檢出率，探討該多重PCR技術對兒童肺炎細菌性病原的診斷價值，指導臨床兒童肺炎診治工作，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～7月在我院就診的300例肺炎患兒，提取呼吸道分泌物，其中男204例，女96例，年齡1個月～9歲，平均年齡（5.6±1.2）歲，病程2～90d。均符合肺炎臨床診斷標準，并獲得父母知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑

全自動微生物檢定儀（VITEK-32）購自法國Bio Merieux；懸浮點陣儀（Luminex 100）購自美國LUMINEX；PCR儀（ABI 5700）購自美國ABI；高速離心機（Allegra X-12R）購自美國BeckmanCoulter；肺炎支原體PCR檢測KIT購自廣州達安基因；HAII試劑盒和ResPlex Ⅰ細菌面板均購自美國GENACO；細菌基因組DNA提取KIT購自美國AXYGEN；普通血平板培養基購自廣州華鑫公司。

1.3方法

采集深部呼吸道分泌物后立即送至細菌室。（1）細菌培養及鑒定將采集的標本分別接種于普通血平板、流感嗜血桿菌巧克力培養基和肺炎鏈球菌培養基。流感嗜血桿菌接種后做革蘭染色及X、V因子鑒定。其余菌落應用微生物鑒定儀進行鑒定。（2）提取細菌基因組、設計14種細菌特異性引物及擴增靶基因14種病原菌及其靶基因：肺炎鏈球菌（SPN）靶基因LytA，金黃色葡萄球菌（SA）Nuc，流感嗜血桿菌（HINF）OmpP2，肺炎克雷伯桿菌（KPN）Khe，嗜肺軍團菌（LPN）Mip，銅綠假單胞菌（PA）AlgD，大腸埃希菌（ECO）Eac，鮑曼不動桿菌（ABM）Npol，奇異變形桿菌（PM）Topoiso，陰溝腸桿菌（ECL）AmpC，化膿鏈球菌（SPY）Mf，腦膜炎奈瑟菌（NMG）CtrA，屎腸球菌（EFCM）Ddl，肺炎支原體（MPN）MPN592，糞腸球菌（EFLS）Ddl。（3）多重PCR擴增：反應體系為35.8μL Rnase-freewater，5μL緩沖液，1μL dNTP，6μL引物，0.2μLHotstar Taq聚合酶和2μL DNA樣品。反應條件參考說明書（95℃變性15min，94℃設定30s，52℃設定1min，72℃設定1min，以上進行15個循環；94℃15s，70℃90s，進行6個循環；94℃15s，52℃15s，72%15s進行30個循環；最后72%維持3min）。（4）擴增產物檢測：按照懸浮點陣儀（Luminex 100）說明書進行操作。所獲熒光強度中位值高于250（或為陰性平均值加5倍標準差）判定為陽性。（5）肺炎支原體熒光定量PCR檢測：參考試劑盒說明書進行，同時將標本號、陰性質控及陽性梯度進行標記。循環反應條件為：93℃設定2min，93℃設定45s。55℃設定60s，循環數為10；93℃設定30s，55℃設定45s，循環數為30，分析結果。

1.4統計學分析

應用SPSS10.0軟件包對統計進行分析，兩組間比較采用x²檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1多重PCR與細菌培養結果比較

多重PCR檢測的總體的陽性率低于細菌培養，與細菌培養比較275例多重PCR敏感性為51.6%，特異性為68.6%，符合率為58.9%。見表1。

2.2多重PCR與5種細菌培養結果比較

多重PCR對SPN檢出率（15.7%，47/300）高于培養（5.7%，17/300）（P<0.05）；對HINF檢出率（22.3%，54/300）與培養（203%，64/300）之間差異無統計學意義（P>0.05）。5種細菌的多重PCR與細菌培養結果比較見表2。

參考5種細菌培養，多重PCR的特異性和符合率均高于細菌培養結果，對SPN、PA的敏感性高于細菌培養的，相關指標見表3。

2.3聯合檢測結果分析

聯合檢測結果細菌性病原檢出率為80.67%（242/300），聯合檢測提高流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌檢出例數。見表4。

3討論

世界衛生組織（WHO）在2005年公告，5歲以下兒童的死亡原因中，肺炎仍居于第一位，全世界每年死于肺炎的兒童大約有200萬，其主要病原為細菌性，其次為病毒、支原體、衣原體等。在病原學診斷方法中，PCR擴增為目前應用最多的分子診斷技術，因其在敏感度、速度、安全性、準確性的優勢，在難以常規培養的病原體如病毒、支原體、衣原體等的檢測方面發揮了重要作用。單PCR一次只能檢出一種病原或一類，在病原學的鑒別診斷方面存在缺陷，而多重PCR在一次檢測中可以同時查出多種病原，已廣泛應用于病原學診斷、耐藥基因檢測等研究領域。是病原學鑒別診斷未來發展方向，在病毒性肺炎病原學診斷方面，國內外均取得了比較滿意結果。近些年，隨著抗生素的早期廣泛應用，增加了細菌培養檢出率的難度，而采用多種方法進行聯合檢測可以相互補充，提高病原檢出率。

本研究顯示，總體看來多重PCR陽性率低于培養，可能因片段擴增的條件不一，難以均勻的對每種靶基因進行擴增，因此產物較少，從而導致敏感性的降低。而在肺炎鏈球菌的檢測方面，多重PCR對SPN檢出率明顯高于培養，說明多重PCR對肺炎鏈球菌敏感性優于培養。聯合檢測細菌性病原檢出率為80.67%（242/300），高于單獨細菌培養的檢出率，且聯合檢測提高流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌檢出例數和銅綠假單胞菌的檢出率，可以體現聯合檢測的優勢，這與國內外其他專家學者報道一致。

綜上，多重PCR技術對檢測肺炎鏈球菌的敏感性較高，而對檢測其他細菌性病原的敏感性還有待提高。多重PCR技術聯合細菌培養能提高兒童肺炎細菌性病原檢出率。臨床工作中可以綜合考慮各種檢測方法的優勢，靈活運用，提高病原學診斷，促進治療。