缺氧誘導因子—1α和M2型丙酮酸激酶在膽管癌細胞中的表達及對糖酵解的影響

張楠　偰光華

[摘要]目的分析缺氧誘導因子-1α和M2型丙酮酸激酶在膽管癌細胞中的表達情況及其對糖酵解的影響。方法分別以不同濃度的氯化鈷溶液誘導的缺氧條件下培養膽管癌QBC939細胞，測定并比較培養24h后各組細胞HIF-1α、PK-M2蛋白表達水平和乳酸分泌量。結果缺氧組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達水平均顯著高于常氧組，膽管癌QBC939細胞24h乳酸分泌量，隨氯化鈷濃度逐漸增加，且均顯著高于常氧培養時分泌的乳酸量，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。經Pearson相關分析法分析，PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關（r=0.436，P=0.002）。結論缺氧誘導因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細胞中的蛋白表達水平顯著提高，且均在膽管癌細胞糖酵解水平的升高過程中發揮重要作用。

[關鍵詞]缺氧誘導因子-1α；M2型丙酮酸激酶；膽管癌；糖酵解

[中圖分類號]R735.8 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-34-03

膽管癌是十分常見的一種消化系統惡性腫瘤，發源于膽管上皮細胞，在所有消化系統惡性腫瘤的患者中占到3%，以低分化膽管癌為主，有男性發病率高于女性，60～65歲人群中高發的特點[2-41。本文就氯化鈷誘導的缺氧條件下，人膽管癌QBc939細胞中HIF-1α、PK-M2的蛋白表達變化情況進行分析，并探討其對糖酵解的影響情況?，F報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇人類膽管癌細胞株OBC939（購自上海和元生物技術有限公司）作為實驗細胞株，以氯化鈷為缺氧模擬劑誘導缺氧條件。

1.2方法

將購買的在液氮中凍存的細胞進行復蘇和傳代處理，其中，細胞的復蘇主要包括恒溫水浴融化、DMSO稀釋、離心分離、DMEM培養基（含1%青鏈霉素以及10%FBS的混合液）加入、細胞培養箱培養等步驟；細胞傳代則是在培養皿中的細胞覆蓋率達到80%～90%時，用含EDTA的胰蛋白酶消化、細胞懸浮、離心分離后轉移并在含完全培養基的培養皿中繼續培養，按1：3～1：5的比例傳代。再次經消化、分離、懸浮、冷凍后保存。

選取已傳3～4代，生長狀態良好的膽管癌QBC939細胞接種培養，并行分組處理。常氧培養是在37℃、5%CO₂、飽和濕度的條件下將膽管癌QBC939細胞放入DMEM培養基中進行培養，將其作為對照組；觀察組則是將膽管癌QBC939細胞置于含缺氧模擬劑的DMEM培養基中培養，缺氧模擬劑為氯化鈷，分設氯化鈷濃度為100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L等四，J、組，培養24h后收獲細胞，經細胞蛋白提取與濃度測定（BCA法）對不同條件下缺氧誘導因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細胞中的蛋白表達水平進行檢測。

同時，收集常氧狀態下與缺氧24h后不同小組組內人膽管癌QBC939細胞培養的上清液，采用比色法對其乳酸濃度進行測定，所有操作均嚴格遵照乳酸濃度測定試劑盒說明書的要求進行，重復6次，收集數據。

1.3統計學方法

數據采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同組別膽管癌HIF-1α、PK-M2的蛋白表達水平比較

比較不同組別膽管癌QBC939細胞中，HIF-1α、PK-M2的蛋白表達水平，可見，觀察組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達水平均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。其中，HIF-1α蛋白表達量在氯化鈷濃度為150μmol/L最高，而HIF-1α蛋白表達量受氯化鈷濃度影響較小。經Pearson相關分析法分析，PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關（r=0.436，P=0.002）。見表1。

2.2不同組別膽管癌QBC939N胞24h乳酸分泌量比較

比較不同缺氧環境下，膽管癌QBC939細胞24h乳酸分泌量，可見隨氯化鈷濃度增加，乳酸.分泌量逐漸增加，且均顯著高于常氧培養時分泌的乳酸量（8.025±1.234），比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

調查顯示，近年來，膽管癌的發病率有不斷升高的趨勢，由于其發病原因尚不十分明確，治療中多以手術切除為首選方法，但膽管癌細胞的發病相對隱匿，早期診斷困難，患者就診時多以發展至晚期，腫瘤惡性度高，且有遠處轉移、局部浸潤情況的發生，有手術切除率低，復發率高，術后生存率低，預后差的情況。在手術切除的基礎上輔以化學藥物進行綜合治療是比較理想的方法。如何從分子水平上對膽管癌的發生、發展情況進行分析，并采取有效的基因靶向治療則是腫瘤化療的新方向。

其中，HIF-1可在腫瘤的缺氧過程中發揮誘導作用，促進VEGF、EPO、PK、HK、LDH等多種關鍵生長調節因子的表達，參與影響腫瘤能量代謝、侵襲轉移、微血管生成、耐受放化療等過程。而PK則是糖酵解途徑中最后一步反應的限速酶，膽管癌組織中血供極差以及供氧不足時呈PK-M2高表達。本研究也發現，在氯化鈷誘導的缺氧環境中，HIF-1α、PK-M2蛋白表達水平均顯著高于常氧組，同時乳酸分泌量顯著增加，提示其均在膽管癌細胞糖酵解水平的升高過程中發揮重要作用，這對于膽管癌相關化療藥物的開發有一定指導意義。呂品等研究了低氧對膽管癌細胞增殖的影響及與HIF-1α表達的關系，同樣發現在不同的氯化鈷誘導濃度下，膽管癌的細胞增殖、膽管癌細胞周期都受到顯著影響，從相關分析曲線上看，在低氧條件處理72h后，會有QBC939膽管癌細胞G1期細胞下降，而s期、G2期細胞增加的情況，且有氧化鈷濃度升高，G1期細胞不斷下降的表現，HIF-1α表達灰度值變化規律與本文結果基本一致，共同說明了膽管癌細胞糖酵解水平與HIF-1α息息相關。柴浩等對M2-型丙酮酸激酶在膽管癌組織中的表達情況研究中，確定膽管癌組織中PKM2表達明顯高于癌旁組織，提示其在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，其也與膽管癌細胞糖酵解水平的升高息息相關。