IL—17體外促進小鼠脾淋巴細胞對髓母細胞瘤的生長抑制作用

孫安　周慿　花緯

[摘要]目的研究在脾細胞抗髓母細胞瘤的免疫過程中，IL-17所起的免疫調節功能。方法將小鼠脾臟取得的脾淋巴細胞在不同濃度的IL-17下與髓母細胞瘤Daoy細胞株共培養，以Daoy細胞株單獨培養組作為對照，用二苯基溴化四氮唑藍法測定細胞毒性效應。結果實驗結果發現各組Daoy細胞株和脾細胞共培養組在不同濃度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）條件下細胞抑制率有統計學意義（P<0.01），且IL-17在一定濃度范圍內（20～80ng/mL），IL-17濃度越高，髓母細胞瘤的細胞生長抑制率越大。此外且隨著時間的增加，各組腫瘤細胞的生長抑制率也均有增加。結論IL-17在一定濃度范圍內能增加小鼠脾細胞對髓母細胞瘤Daoy細胞株的生長抑制作用，且在一定時間段內，隨著時間的增加，各組腫瘤細胞的生長抑制率也均有增加。

[關鍵詞]髓母細胞瘤；IL-17；Th17細胞；MTT法；細胞生長抑制率

[中圖分類號]R739.41 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-30-04

髓母細胞瘤是兒童最常見的原發性惡性腫瘤之一，惡性程度高，不但手術后容易復發，還可沿蛛網膜下腔轉移到腦脊髓和腦室各處，治療困難，在惡性腫瘤的治療新方法的探索中，目前腫瘤的免疫治療也越來越被重視，本研究探討在脾細胞抗髓母細胞瘤的免疫中，IL-17所起的免疫調節功能。

1材料與方法

1.1一般材料

細胞株：髓母細胞瘤Daoy細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所；采用含10%胎牛血清FBS（上海啟凡生物科技有限公司，貨號：1099141）、105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素（上海啟凡生物科技有限公司，貨號：15140122）的MEM培養液（GIBCO公司，貨號：11095-072），置于37℃、5%CO₂培養箱（Thermo公司，型號：3111）內培養進行培養，取對數生長期細胞進行試驗。

1.2小鼠脾淋巴細胞制備

Balb/c雄性小鼠由復旦大學醫學院神經生物國家重點實驗室提供，取12只6周齡的小鼠，通過脫頸椎處死，在無菌條件下手術取脾，用Hanks液洗滌1次后，置于200目金屬網上進行研壓碾磨過濾，收集網下脾細胞懸液。濾過的脾細胞以1000r/min離心5min，棄上清液，加紅細胞裂解液溶解紅細胞，反復洗滌后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液（GIBCO公司，貨號：31800-022），調整細胞濃度為1×10⁷/mL。加入ConA至3mg/mL，置于37℃，5%CO：培養箱中培養。

1.3 MTT法進行體外細胞殺傷活性實驗

實驗組以1×10⁵/mL髓母細胞瘤Daoy細胞株為靶細胞，1×10⁶/mL小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞，混合后接種到96孔板，每組4個復孔，除對照組外，各組共培養液加入不同濃度的IL-17（ProSpec公司，貨號：CYT-640）；以未加入脾淋巴細胞的單純髓母細胞瘤Daoy細胞株為對照組。各組均置于37℃，5%CO₂孵箱內共培養，分別在24h、48h、72h后，加入5mg/mL的MTT溶液（Duchefa公司，貨號：P215600）20μL，37℃繼續培養4h后棄上清終止培養；每孔加入DMSO 200μL，37℃振蕩10min，在酶標儀（Thermo公司，型號：Multiskan FC）490am處測各孔光吸收度（OD），計算各組細胞的殺傷率。殺傷率=[（對照組平均0D490值一實驗組平均OD490值）/對照組平均OD490值]×100%。結果見表1。

1.4統計學處理

采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析及S-N-K法檢驗。所有的變量均以（x±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 IL-17可增加脾淋巴細胞對髓母細胞瘤Daoy細胞株的生長抑制作用

髓母細胞瘤Daoy細胞株和小鼠脾淋巴細胞進行共培養，用MTT法測定未加入IL-17和加入不同濃度的IL-17的各組的體外細胞殺傷活性。實驗分別對24h、48h和72h各組生長抑制率用SPSS16.0軟件進行單因素反差分析，結果見表1和圖1：顯示不同濃度IL-17組的細胞抑制率有顯著統計學差異（24h，F=1327，P<0.01；48h，F=2198，P<0.01：72h，F=1290，P<0.01）。進一步進行S-N-K法檢驗，發現Daoy細胞株+脾細胞+不同濃度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）各組的細胞抑制率有統計學差異（注：S-N-K法檢驗SPSS16.0軟件僅在無統計學意義組顯示P值）。且IL-17在20～80ng/mL范圍內，髓母細胞瘤的細胞生長抑制率越隨著IL-17濃度的增高而增加（表1，圖1）。

2.2 IL-17對脾淋巴細胞的促進作用與時間成正比

對各時間點的Daoy細胞株生長抑制率進行單因素反差分析及S-N-K法檢驗，發現各組在不同共培養時間的生長抑制率有統計學差異（根據IL-17濃度分組：0ng/mL，F=947，P<0.01；20ng/mL，F=67，P<0.01；40ng/mL，F=273，P<0.01；60ng/mL，F=79，P<0.01；80ng/mL，F=11，P<0.01；100ng/mL，F=18，P<0.01），并且實驗發現脾細胞對腫瘤細胞的生長抑制作用隨著時間的增加而增加，結果有統計學意義，見表1。

3討論

髓母細胞瘤是兒童最常見的原發性惡性腫瘤之一，惡性程度高，由Bialy和Cushing首先發現并命名。髓母細胞瘤不但手術后容易復發，還可沿蛛網膜下腔轉移到腦脊髓和腦室各處，治療困難，是現代神經外科的治療難題之一。此外髓母細胞瘤多位于四腦室內，容易與腦干粘連，導致手術全切困難。并且手術后患兒多需要進行化療和全腦脊髓放療，但兒童對放、化療的耐受差，并且放、化療還會影響兒童的生長發育，因此有必要尋找新的治療方法治療髓母細胞瘤。在髓母細胞瘤的治療新方法的探索中，目前腫瘤的免疫治療也越來越被重視。

Th17細胞的概念在近年來被提出，是近來發現的一類CD4*T細胞，因為這一類T細胞亞群以產生白介素IL-17（Interleukin-17）為特點，被命名為Th17細胞（也叫輔助性T細胞17亞群或產生IL-17的T輔助細胞，T helper17cell or IL-17-producing T helper，Th17），Th17細胞產生的最重要的效應因子是IL-17，IL-17具有強烈促炎癥作用，其受體在體內表達廣泛。

IL-17能夠刺激上皮細胞、內皮細胞或成纖維細胞產生白介素IL-6、IL-8、INF-gamma、G-CSF等細胞因子，這些細胞因子的作用還可有助于CD8+T細胞和DC細胞趨化積聚，引起局部組織淋巴細胞浸潤和腫瘤組織破壞。目前已有研究發現Th17細胞與IL-17與前列腺癌、髓母細胞瘤、卵巢癌等腫瘤均有一定在關系。

四唑鹽（MTT）比色試驗是一種檢測細胞存活和生長的常用方法。本實驗采用MTT法檢測了與脾淋巴細胞共培養的髓母細胞瘤Daoy細胞株的生長抑制情況，發現IL-17（20～100ng/mL），可增加脾淋巴細胞對共培養腫瘤細胞的生長抑制作用；并且在一定時間范圍內（24～72h），隨著時間的延長，Daoy細胞株的生長抑制率也增加。并且我們發現在一定濃度范圍內（20～80ng/mL），隨著IL-17的濃度增加，脾淋巴細胞對髓母細胞瘤Daoy細胞株的生長抑制作用也增強。

近年來在研究發現Th17細胞在抗腫瘤免疫中也起了重要的作用。甚至Th17與部分腫瘤疾病臨床預后相關，可能成為某些腫瘤治療的篩選指標和療效及預后的預測因子。在黑素瘤和纖維肉瘤中發現Th17細胞具有增強抗腫瘤免疫的功能。Th17細胞可加強腫瘤組織中的炎癥反應，增強CD8+細胞毒性T細胞和DC細胞在腫瘤中的浸潤，激活腫瘤組織特異的CD8+細胞毒性T細胞發揮抗腫瘤功能。

而IL-17是Th17細胞在主要效應因子，Th17細胞通過IL-17發揮其免疫調節作用。有研究發現在IL-17缺陷的小鼠更易發生肺黑色素瘤，用分泌IL-17的T細胞治療可有效減小腫瘤的發生幾率。更重要的是，在IL-17的輔助下，Th17細胞表現出比Th1細胞更強的治療功效，使用Th17細胞治療可有效激活腫瘤特異性的CD8*T細胞。Th17細胞還能召集樹突狀細胞聚集到腫瘤組織中。本實驗發現IL-17在髓母細胞瘤在抗腫瘤免疫中也起了一定在作用，其中在作用機制還有待于我們在今后的工作中進一步探索。

在一定濃度范圍內（20～80ng/mL），IL-17可增加脾淋巴細胞對髓母細胞瘤Daoy細胞株的生長抑制作用，并且在一定時間范圍內（24～72h），隨著時間的延長，脾淋巴細胞對Daoy細胞株的生長抑制率也增加。