高效液相色譜—質譜聯用技術在中藥研究中的應用進展

韋建喬　韋波

[摘要]高效液相色譜一質譜聯用（LC-MS）將高效液相色譜的高分離效能與質譜的強大結構測定功能組合起來，不僅實現對復雜混合物更準確的定量和定性分析，而且簡化了樣品的前處理過程，樣品分析更簡便，為中藥組分的分析及結構的鑒定提供了一個重要和全新的技術支撐。該技術對中藥化學成分的分析及鑒定，中藥指紋圖譜的研究，中藥藥代動力學的研究有應用價值。論述了高效液相色譜-質譜聯用（LC-MS）在中藥領域的應用進展，闡述了各方法的特點、應用范圍及研究現狀，旨在為中藥研究者提高參考依據。促進中藥研究向現代化的發展。

[關鍵詞]高效液相色譜質譜聯用；中藥；指紋圖譜；藥代動力學

[中圖分類號]R284.1 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-44-03

作為一種新的現代技術分析手段，高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術在分離效能、靈敏度和專屬性等方面都有著巨大的優勢，展現出強大的定性、定量分析能力，從而在藥物分析特別是中藥分析得到廣泛的運用。本文就近年來HPLC-MS聯用技術在中藥成分分析及結構的鑒定、中藥指紋圖譜研究、中藥藥代動力學研究3個方面的應用作一論述。

1高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術有獨到的優勢和特點

當用傳統的高效液相色譜（HPLC）測定樣品時，樣品中的雜質對主成分有較大的干擾，主峰不易分離，峰型也不好，準確性有影響但卻找不到好的辦法時，高效液相色譜一質譜（LC-MS）可以排除其他雜質的干擾，即使主成分在色譜上沒有完全分離開，但通過MS的特征離子質量色譜圖也能給出它的色譜圖來進行定性定量。采用高效液相色譜-質譜（LC-MS）分析時其流動相主份相對于傳統高效液相色譜（HPLC）法更少更簡單，色譜柱更短更小（常用規格是2.1mm×50mm，1.8μm），出峰時間大大縮短，卻可以得到很好的分離效果，短時間內可完成對一個樣品的分析，操作簡單、重復性好。更適合于大批量樣品的測定。高效液相色譜一質譜（LC-MS）還可以用相對簡單的色譜條件對中藥中多種成分的定性、定量分析，比如分析西青果中的訶子酸、訶黎勒酸、鞣云實精、原訶子酸等化合物，方法簡便，分析時間短。而用傳統的高效液相色譜法（HPLC）測定時不僅要用到不同的色譜條件，且洗脫、分離效果往往不好，分析時間也很漫長。

2液質聯用技術在中藥研究中應用進展

2.1在中藥成分分析以及中藥結構鑒定中的應用

中藥的成分多而復雜，且傳統的分離鑒定方法（提取一分離一結構鑒定）耗時、耗力、重復性強，技術難度也較大。因此，其化學成分的檢測成為中藥研究中主要解決的問題。而LC-MS將LC的高分離效能與MS的測定功能組合起來，不僅可以對復雜混合物進行定性和定量分析，而且對樣品的前處理要求不是很高，為中藥組分分析、結構鑒定等，提供了一個全新的技術支撐。

白雪等采用液相色譜-離子阱-飛行時間質譜（LCMC-IT-TOF）對金銀花中的化學成分進行快速準確地定性分析，得到高分辨、高精度的一級、二級質譜數據，結合高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）數據分析以及Formula Predictor分子式預測，鑒定了金銀花中的17種化學成分，包括6個有機酸類成分，3個黃酮類成分和8個環烯醚萜成分。孫冬梅等使用超高效液相色譜一四級桿-飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS）測定銀杏磷脂軟膠囊甲醇提取物中化學成分，在優化的液質聯用條件下，通過對照品、數據庫匹配及文獻數據，鑒定為槲皮素（quercetin）、芹菜素（apigenin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素-3-0-[2-0-（β-D-葡萄糖基）]-α-L-鼠李糖苷（quercetin 3-0-[2-0-（B-D-glucosyl）-α-L-rhamnoside]）等12種黃酮類成分。譚銀豐等運用液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS），在電噴霧離子源正離子模式下（ESI+），采用多反應監測模式（MRM）對可能的化合物進行針對性分析。結果在高良姜葉的甲醇提取液中共鑒定出分屬于兩類成分的16個化合物，其中黃酮類物質白楊素、喬松素、楊芽黃素、芹菜素、高良姜素、高良姜素-3-0-甲醚、金合歡素、山柰酚、山柰素、槲皮素、異鼠李素、蘆丁。二芳基庚烷類成分包括益智酮甲、益智醇、六氫姜黃素和hannokinol。王樂奇等采用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用技術（LC-ESI-MS）對鉤藤藥材的乙醇提取物的化學成分進行分析鑒定，結果共分離鑒定出6個化學成分，主要為生物堿類成分，分別為：鉤藤堿、烏索酸、異鉤藤堿、柯諾辛堿B和二氫柯楠因堿。

2.2在中藥指紋圖譜研究的應用

指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學成分系統研究的基礎上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優良性和穩定性。其主要特點表現在“整體性”“模糊性”。中藥成分復雜，含雜質多，分離提純難度大。研究表明，中藥的藥效是多成分共同作用的結果，不可能是某幾個主要成分或者指標成分在起作用，中藥指紋圖譜技術已經逐步成為技術檢測中成藥特別是中藥材質量的有效手段。液質聯用技術在對未知成分的研究中，其原理就是由串聯質譜得到的特征碎片離子等結構信息，結合已知結構化合物的裂解等規律，來對未知成分進行定性、定量分析整好滿足中藥指紋圖譜研究的需要。

曹樹萍等采用超高液相色譜（UPLC）技術建立參麥注射液的指紋圖譜快速檢測方法，并利用離子阱質譜聯用技術對其特征性成分進行分析，結果建立了全國3個廠家19批參麥注射液UPLC譜指紋圖譜，利用多級質譜信息，結合對照品和文獻對12個共有峰進行指認。19批參麥注射液除2批外相似度均高于0.85。聚類分析結果顯示不同廠家的參麥注射液各自聚為一類。汪祺等采用超高效液相色譜建立生脈注射液指紋圖譜，并應用超高效液相色譜一離子阱質譜聯用技術對主要色譜峰進行指認，標定了18個共有峰，8個生產企業的相似度除2個企業外均高于0.9；利用二級質譜信息，結合對照品及文獻報道，確定18個共有峰化合物的可能結構。超高效液相指紋圖譜可快速有效地評價生脈注射液的產品質量。韋英杰等用高效液相色譜方法（帶有二極管陣列檢測器），以川續斷皂苷Ⅵ為參照物建立續斷色譜指紋。采用高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術首次分析其中化學成分的質譜特征。最后確定了續斷藥材的17個共有峰，由于該方法（指紋圖譜）具有較高的精密度，較好的穩定性和重復性，對續斷藥材的質量評價具有很大意義。高效液相色譜一質譜（LC-MS）聯用技術鑒定了該藥材中30多個化合物的相對分子量，通過多種方式對照，對其中10個具有特征的成分進行了推測，并確認。并用高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術對續斷指紋圖譜中的特征峰進行結構確認，可使其色譜指紋圖譜的特征性更強，對續斷藥材的質量控制得到一個很大的提高。

2.3中藥藥代動力學研究中的應用

藥物代謝動力學（Pharmacokinetic）是定量研究藥物在生物體內吸收、分布、代謝和排泄規律，并運用數學原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規律。LC-MS技術由于其具有快速、微量、專屬、準確的特點，除了可確定分子量之外，還可以根據特異性斷裂規律推導出重要部分結構甚至是完整的結構。因此，LC-MS技術已成為藥物代謝研究中不能替代的一種強有力的分離分析工具。

皮子鳳等采用基于超高效液相色譜與串聯四級桿飛行時間質譜儀（UPLC/Q-TOF-MS）聯用技術的代謝組學方法，進行了五味子治療糖尿病腎病大鼠血清代謝組學研究。共鑒定了7種內源性代謝產物，分別為黃尿酸、油酰胺、棕櫚酰胺、尿素、5-羥基己酸、硫酸對甲酚和對甲酚葡萄糖苷酸，說明五味子通過影響色氨酸代謝、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、腸內菌代謝等通路發揮治療作用，其中嘌呤代謝、腸內菌代謝通路是其減少腎病損傷的重要作用途徑。從五味子整體作用角度初步闡明了其治療糖尿病腎病的作用機制。

秦春雨等建立大鼠血漿中雷公藤內酯醇的超高效液相色譜質譜聯用（UPLC-MS/MS）法測定大鼠灌胃給藥與靜脈注射給藥后的血漿藥物濃度，并進行藥代動力學參數評價。Sprague Dawley大鼠分別經灌胃與尾靜脈注射給藥，經頸靜脈取血，測定不同時間的大鼠血漿藥物濃度，并計算其主要藥代動力學參數。結果在0.1～200.0ng/mL質量濃度范圍內，血漿雷公藤內酯醇線性關系良好，血漿中雷公藤內酯醇的定量限為0.1g/ml，該藥穩定性良好，回收率均在95%以上，日內與日間差異均小于15%。口服與靜脈給藥后，雷公藤內酯醇在大鼠體內的消除均較快，口服生物利用度為9.5%。本研究結果為雷公藤內酯醇的結構優化、劑型改進以及臨床應用提供了實驗依據。

辛楊等采用液-液萃取法對灌胃給予次烏頭堿的大鼠尿液樣品進行純化，利用高效液相色譜一離子阱串聯質譜檢測純化樣品，根據各保留時間對應化合物的多級串聯質譜數據，并與文獻對照，推斷次烏頭堿在大鼠尿液中代謝產物的結構。結果與空白組大鼠尿液相比，在次烏頭堿給藥大鼠的尿液中共檢測到4個烏頭類生物堿，分別為次烏頭堿原型化合物，18-0-去甲基次烏頭堿，N-去甲基次烏頭堿，被標識為羥基化的代謝物。研究表明次烏頭堿在大鼠體內可能發生了去甲基、羥基化代謝反應，為該成分的藥效作用研究提供參考。

3小結

綜上所述高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術以其高分離能力、高靈敏度以及高選擇性，并且應用范圍廣，具有強的專屬性等特點，對傳統中藥的研究會是一個很大的突破，在中醫藥現代化研究中得到越來越廣泛的應用。此外，高效液相色譜-質譜（LC-MS）聯用技術無論在藥物的分析、篩選方面，還是在農藥殘留、環境安全以及食品分析等方面也得到了廣泛的應用。隨著技術的更新發展，相信高效液相色譜一質譜（LC-MS）聯用技術在中醫藥領域發揮著巨大的作用和美好的應用前景。