體細胞核移植技術的研究進展

張鵬

[摘要]體細胞核移植這是近年來人類在細胞生物學及發(fā)育生物學領域取得的最偉大的成就之一，他的成功表明動物體細胞的分化是可逆的。然而體細胞核移植的基礎理論以及技術研究目前還有很多薄弱點，存在著克隆成功率較低等問題，在一定程度上限制了它的發(fā)展。本研究根據(jù)近年體細胞核移植技術的研究情況，對應用這項技術進行克隆的主要步驟、該技術在生物學、醫(yī)學等領域的應用前景以及目前仍需克服的一些問題作一綜述。

[關鍵詞]體細胞；核移植；克隆；表觀遺傳重構

[中圖分類號]Q819 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-40-04

一直以來研究人員普遍認為只有通過卵子和精子相互結合形成受精卵，隨著受精卵的不斷分化，最終才能發(fā)育成為一個新的生命，但在這個過程中，受精卵細胞同時也將逐漸地失去其發(fā)育成為完整后代的能力，把受精卵細胞具備發(fā)育成為完整個體的能力稱為全能性。體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術的成功歸因于人們對細胞全能性的逐步認識。核移植（NT）就是將動物的體細胞或者早期胚胎卵裂球的細胞核，移植進經去核的發(fā)育成熟的卵母細胞的胞質中或受精卵中，得到重構的卵母細胞，然后通過重新激活，恢復其細胞分裂及分化，從而促使其發(fā)育成為與供體細胞的基因型完全相同的子代，這一技術也可稱為體細胞克隆技術。體細胞核移植技術最早是由德國的胚胎學家Spemann 1938年提出的，他起初提出這個理論，主要是為了研究細胞核全能性的機制以及在胚胎發(fā)育的過程中細胞質與細胞核的相互作用機理。直到1952年Briggs和King按照他的理論，首次成功地進行核移植試驗，他們首先將非洲爪蟾的卵子去除其細胞核，然后向其中移植進其囊胚細胞核，從而得到了正常的后代。隨著胚胎工程技術的不斷進步，人們先后以不同動物的胚胎細胞等作為供體，不斷成功地培育出了各種克隆動物，如克隆羊、克隆牛、克隆豬、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有標志意義的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上報道了他們利用體細胞核移植技術，用成熟綿羊的體細胞（乳腺上皮細胞）作為核供體，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了軒然大波。這一實驗充分證明了高度分化的體細胞仍然具有全能性，人們可以利用體細胞，通過體細胞移植技術獲得基因型與供體細胞基因型基本相同的子代個體。成為了生物學以及遺傳學發(fā)展史上一個重要的里程碑事件。家兔是生物醫(yī)學研究中最常用的實驗動物之一。利用體細胞核移植技術生產克隆兔子是目前研究的熱點，在生物醫(yī)學領域具有十分誘人的應用前景。而家兔被認為是利用體細胞核移植技術難以成功克隆的哺乳動物之一，直到2002年法國學者Patrick Chesne等用卵丘細胞作為核供體首次成功克隆了家兔，突破了家兔難以成功克隆的關鍵問題，為擴大家兔在生物醫(yī)學方面的應用研究提供了方法。應用這項技術，2006年我國學者李善剛博士應用成纖維細胞作為核供體成功地培育出克隆家兔，在此基礎上他又進一步將轉基因技術與體細胞核移植技術結合起來，成功培育出了表達綠色熒光蛋白的克隆兔，將該項技術推向新的高度。

1體細胞核移植的主要方法

具體來講，體細胞核移植技術主要包括受體細胞的去核、核供體細胞的準備與選擇、細胞周期的調控、細胞融合、重組胚胎細胞的激活以及培養(yǎng)等步驟。

1.1受體細胞的選擇

在哺乳動物體細胞核移植的實驗中，可以作為受體的細胞主要有以下三種：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母細胞；（3）去核的早期胚胎細胞，其中MⅡ期卵母細胞是目前采用較多的核移植受體細胞，因為在這個時期，一方面該細胞體積較大，便于顯微操作；另一方面重組胚胎所需要的各種細胞因子在MⅡ卵母細胞質中均存在，而且細胞營養(yǎng)成分充足。在細胞分裂過程中，結合在DNA上的各種細胞因子如轉錄因子等從DNA螺旋軸上脫離下來，與此同時胞質中的大量重組因子即可與DNA螺旋軸結合，從而促進基因重組的發(fā)生。另外一方面，因為選擇合適卵齡的卵母細胞作為胞質受體，對體細胞核移植是否能夠成功產生巨大的影響，故細胞培養(yǎng)的時間也特別重要，實驗中一般多選擇培養(yǎng)40～44h，傳代4～6代的卵母細胞作為受體細胞。因為大量的實驗證明，傳代越多重組胚的囊胚率也越多。

1.2受體細胞去核的方法

先要對受體細胞進行去核，才能進行供體核的移植。受體細胞去核必須完全，如果去核不完全，一方面可能導致重組的胚胎細胞染色體形成非整倍體或多倍體從而使克隆直接失敗，另一方面也可能使卵母細胞產生異常分裂進而發(fā)育受阻甚至可以導致胚胎的早期死亡從而使克隆最終失敗。所以是否完全使卵母細胞去核，是保證核移植所形成的新的胚胎細胞能否發(fā)育成為正常個體的前提條件。為了減少實驗中的干擾因素，可以通過縮短體外操作的時間并快速而準確的去除受體細胞核以避免孤雌發(fā)育。大體上受體細胞去核的方法可以分為兩種方法，即化學去核法和機械去核法。具體有以下幾種操作方法（1）盲吸法：這一方法的優(yōu)點是不用借助于其他的化學物質，但此法耗費時間較長、易影響細胞質空間結構故對卵母細胞損傷比較嚴重，所以技術要求較高，不同動物去核率相差也較大，應用較少；（2）半卵法：這個方法是應用特制的卵母細胞切割刀，將卵母細胞切割成為兩個半卵，然后丟棄含有極體的那一半半卵細胞，用兩個不含極體的半卵細胞與供體細胞核進行融合，構建核移植胚胎。（3）化學試劑去核法：這種方法的原理是利用蔗糖或者脫羰秋水仙堿等化學試劑的作用，使受體細胞能夠自行排出第二極體，從而實現(xiàn)去核的目的，但目前還不清楚化學試劑是否對受體細胞造成損傷；（4）擠壓法及點壓法：此兩種方法均是利用固定管固定住細胞，使細胞染色體位于特定位置，然后擠壓透明帶，用去核針取出第一極體，再用熒光染料Hoechest33342染色后觀察其去核率。點壓法是擠壓法的改進方法，優(yōu)點是對卵母細胞胞質的損傷較小，在去核操作的過程中不用更換去核針，節(jié)省了時間，有效的提高了去核效率；（5）紡錘體探測技術：此法去除細胞核的方法是將卵母細胞放置于Spindle-view偏振光系統(tǒng)的倒置顯微鏡下，受體卵母細胞的紡錘體區(qū)域較其它部位明亮，從而清楚顯示其染色體位置，而后再用去核針通過顯微鏡下操作去核，以利于去核的操作準確完全。（6）透明帶膨脹輔助去核法：此法是先用去核針吸入適量操作液后稍施正壓，使吸入的操作液平緩流出，推進去核管，使透明帶逐漸膨脹，然后用去核針將細胞核取出，此法的優(yōu)點是縮短了去核操作的時間并且顯著地提高了去核操作后卵母細胞的生存率。（7）離心去核法：這個方法的原理是根據(jù)細胞質的密度小于細胞核，通過離心的方法將沒有透明帶的細胞核甩向一側進而脫離卵母細胞。該方法的缺點是必須去除透明帶，不利于之后核移植胚胎的發(fā)育。

1.3供體細胞選擇與核的移植

實驗中可用于核供體的細胞很多，主要有胚胎干細胞（ES細胞）、卵丘細胞、顆粒細胞、睪丸支柱細胞、精子細胞、乳腺細胞、神經細胞以及成纖維細胞等，其中最主要的是兩種：一是生殖細胞如卵丘細胞，二是胎兒或成年成纖維細胞。影響核移植成敗的一個重要因素是受體與供體細胞的細胞周期同步化發(fā)育，早期的研究認為要使體細胞核移植成功必需使供體細胞處于GO期，獲得GO期細胞主要是通過兩種方法：選擇細胞類型或者人工誘導的方法。Inoue等研究人員在小鼠的核移植實驗中發(fā)現(xiàn)，移植的效率較大的受到供體細胞的細胞類型以及其基因型的影響。近年來許多科研人員通過實驗發(fā)現(xiàn)把沒有經過休眠誘導的處于細胞周期中G1期、G2期以至于M期的細胞作為供體細胞進行核移植也可以獲得成功。將供體細胞核移植進入受體細胞的常用方法主要可分為融合法以及注射法兩類。其中融合法中目前最常用的是電融合的方法，這是因為電融合的方法具有細胞損害較小、可重復性好而且融合的效果較好等明顯的優(yōu)點，所以逐漸被廣大的研究人員所應用。電融合方法的原理是通過細胞在強電場短時間的作用下，使細胞膜產生一過性的擊穿，當電流使兩個相鄰的細胞膜接觸的區(qū)域發(fā)生擊穿時，兩側的細胞膜就可以在擊穿的瞬間發(fā)生接觸并融合成為一個細胞。注射法一般分為透明帶下注射和胞質內注射。透明帶下注射是把整個供核細胞注射至受體細胞卵周隙，這就需要在注射后還需使供體細胞與受體細胞進行融合。胞質內注射一般是用壓電一陶瓷微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質內。

1.4卵母細胞的激活

因為缺少了受精這一步驟，在以成熟的卵母細胞作為受體的核移植實驗中，缺少了自然受精過程中受精卵的激活過程，所以必須進行人工激活核移植后重構的卵母細胞從而促使其進一步分化發(fā)育。根據(jù)激活時期的不同，可分為移核前激活、移核時激活、移核后激活三種不同的時期。使卵母細胞激活的方法可以分為化學或者物理刺激的方法兩類。激活方法目前應用較多的有鈣離子載體A23187激活和離子霉素激活、乙醇激活、蛋白質合成抑制劑激活、氯化鍶激活、精子提取物激活、蛋白質磷酸化抑制劑激活以及電脈沖激活、聯(lián)合激活等。雖然卵母細胞可以被以上的各種化學物質以及物理刺激的方法激活，但是卻不可避免地在激活的同時也造成受體細胞一定程度的損害，影響胚胎的發(fā)育。所以，是否能夠盡快地探索出對卵母細胞損傷較小并且激活效率高的激活方法對體細胞核移植技術最終能否成功尤為重要。

2體細胞核移植技術的應用前景

體細胞核移植技術作為細胞生物學及發(fā)育生物學領域取得的最偉大的成就之一，應用前景必然是特別廣闊的甚至是我們一時無法估量的！其潛在的經濟效益是十分巨大的，隨著這項技術的不斷發(fā)展、逐步完善，必將帶來生物學以及醫(yī)學領域的一場深刻變革。這項技術在生物學方面如在保護瀕危動植物物種、新物種的培育、優(yōu)良畜種培育以及轉基因動植物生產方面前景十分廣闊。另外，這項技術在醫(yī)療衛(wèi)生領域同樣具有巨大的應用潛力和發(fā)展前景。尤其在醫(yī)療衛(wèi)生領域，可能為機體損傷修復、器官移植乃至遺傳性疾病、老年性疾病的治療等打下堅實的基礎，有著不可估量的作用，所以值得科研人員持續(xù)關注并為體細胞核移植技術的不斷完善發(fā)展付出不懈的努力。

3目前存在的問題

自從1997年首次報道體細胞核移植克隆羊獲得成功以來，雖然目前科研人員通過體細胞核移植克隆動物已經取得了不少的進展，但是依然存在很多問題，仍缺乏重大突破，比如核移植成功的總體效率仍較低、核移植的胚胎流產率仍然較高以及胚胎發(fā)育異常如“巨胎癥”等問題，一直困擾著廣大的科研人員。有研究人員在實驗中發(fā)現(xiàn)，在以卵母細胞作為受體的核移植小鼠的重構胚胎中，其中90%的染色體結構是正常的，這就說明這些染色體結構正常的核移植小鼠的基因組應該也是正常的，所以他們推測重構胚胎發(fā)育異常絕大部分的原因可能是由于表觀遺傳重構的錯誤造成核移植胚胎的異常。表觀遺傳重構錯誤主要表現(xiàn)在這幾個方面：X染色體失活，基因組印跡，組蛋白乙酰化，DNA甲基化，端粒與端粒酶長度異常等。近些年來，越來越多的體細胞核移植相關實驗逐漸證明了核移植中表觀遺傳重構的錯誤造成核移植胚胎異常這一理論的正確性。雖然當前核移植技術越來越成熟，但是研究人員對造成這種錯誤的原因以及其作用的機制仍未完全清楚。各種原因使得核移植的成功率目前仍然較低（<10%），即使胚胎能夠正常發(fā)育，克隆動物能夠出生，但出生后也經常出現(xiàn)各種異常。所以，進一步研究核重構的分子機制，明確已經高度分化的體細胞在卵母細胞中是如何重新去分化的，以及核移植過程中如何發(fā)生表觀遺傳重構等均是急需研究人員不斷進行探索的問題。