纈草提取物對慢性心力衰竭室性心律失常兔電生理指標的影響*

楊淑紅　曹　紅　胡　河　陳玉婷　徐輝文

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纈草提取物對慢性心力衰竭室性心律失常兔電生理指標的影響*

楊淑紅1,2曹紅2胡河2陳玉婷2徐輝文3

目的：觀察纈草提取物(VOL)對慢性心力衰竭(CHF)致室性心律失常兔電生理指標的影響。方法：雄性新西蘭大耳白兔30只，隨機平分為三組：正常對照組(Control組)、CHF模型組(CHF組)和CHF+VOL組(VOL組)。CHF模型組經耳緣靜脈推注異丙腎上腺素(0.3mg/kg/天，連續注射3周)誘導；Control組平行推注等體積生理鹽水；VOL組對CHF兔持續靜脈滴注濃度為50mg/L的VOL。記錄各組在體心臟左心室單相動作電位(MAP)主要參數靜息膜電位(RMP)、動作電位幅度(APA)、動作電位最大上升速率(Maxdv/dt)和動作電位復極化恢復時程(APD10-90)；觀察各組室性心律失常誘發周長(BCL)、誘發率和心律失常持續時間；分離單個心室肌細胞后，全細胞膜片鉗技術記錄心室肌細胞L-型鈣電流(ICa-L)及電流-電壓(I-V)曲線。結果：與Control組比較，CHF組RMP、APA、Maxdv/dt均明顯降低，APD10、APD20、 APD50和APD90均顯著延長(P均<0.01)；與CHF組比較，VOL組RMP、APA、Maxdv/dt均明顯增加，各APD時程均顯著縮短(P<0.01)。CHF組誘發室性心律失常BCL、心律失常誘發率和持續時間均大于Control組(P<0.01)；VOL組BCL、心律失常誘發率和持續時間均小于CHF組(P<0.01)。當鉗制電位為+20mV時，與Control組比較，CHF組心室肌細胞ICa-L電流密度由(-12.13±0.99pA/pF)下降為(-7.14±0.33pA/pF)(P<0.01)；VOL組則較CHF組ICa-L電流密度明顯上升(-10.86±0.50pA/pF)(P<0.01)，VOL組ICa-L的I-V曲線較CHF組明顯下移，接近Control組。結論：VOL能顯著降低CHF心室肌電生理易損性和室性心律失常易感性，拮抗CHF室性心律失常；其機制可能與VOL可增加心室肌細胞ICa-L有關。

纈草提取物；慢性心力衰竭；單相動作電位；L-型鈣電流；抗室性心律失常；兔

慢性心力衰竭(Congestive Heart Failure,CHF)患者容易誘發室性心律失常，甚至出現心源性猝死等惡性事件[1]。CHF發生機制可能與離子通道表達異常，允許離子電流進出心室肌細胞內外量的多寡密切相關[2]。改善CHF患者的心功能，防止室性心律失常發生是藥物治療CHF的重要節點[3]。抗心律失常藥物能夠有效減少CHF室性心律失常的發生。纈草(Valeriana Officinalis L,VOL)屬于敗醬科纈草屬多年生草本植物[4]，其有效成分纈草單萜堿可通過降低心肌細胞內[Ca2+]i，發揮抗缺血再灌注損傷以及通過作用于Na+電流發揮抗心律失常等效應[5]。但其對CHF誘發心律失常的相關作用及其電生理變化尚不明確。本文采用靜脈注射異丙腎上腺素誘發家兔CHF模型，采用單相動作電位(Monophasic Action Potential,MAP)、全細胞膜片鉗等技術記錄各種電生理指標，探討VOL有效成分提取液對CHF所致室性心律失常的影響和電生理機制，為VOL的臨床應用提供實驗證據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康雄性新西蘭大耳白兔30只，購于武漢生物制品研究所，體重1.5-2.0kg。飼養于本院實驗動物中心(SPF級動物室)，整個飼養過程充分提供動物生活所需濕度、溫度和光線，自由進食和飲水，1-2周后隨機數字表法分為正常對照組(Control組)、CHF模型組(CHF 組)和CHF+VOL有效成分提取物組(VOL組)，每組10只。

1.2實驗儀器

嬰幼兒超聲儀(主機Vivid 7，探頭S4，美國GE公司)；16導電生理記錄系統(PowerLab 16/30，澳大利亞AD公司)；電生理記錄和分析模塊(LabChart Pro V7,澳大利亞AD公司)；Langendorff離體心臟灌流裝置(PowerLab7，澳大利亞AD公司)；倒置顯微鏡(IX70-122，日本Olympus公司)；Pulse+Pulsefit軟件(version8.31，HEKA，德國)；EPC-9放大器(HEKA，德國)；Igor Pro分析軟件(version 3.31，美國)；玻璃微電極(Sutter-7，美國)。

1.3實驗藥物和試劑

VOL有效成分提取液(制備成安瓿，5ml/支)由華中科技大學老年醫學研究所饋贈，參照前期VOL對心肌缺血再灌注實驗結果[5]，本次實驗選擇濃度為50mg/L。自配Tyrode液(mmol/L):NaCl 135.0、KCl 5.4、MgCl21.0、HEPES 10.0、Glucose 10.0，用NaOH調pH至7.35；ICa-L細胞外液(mM)：CsCl 5.4、MgCl21、Hepes 5、Glucose 11,用CsOH調pH至7.4；ICa-L細胞內液(mM)：NaCl 5、CsCl 10、Hepes 5、Mg-ATP 2.5,用CsOH調pH至7.4。異丙腎上腺素、戊巴比妥鈉、Ⅰ型膠原酶、蛋白酶E、小牛血清白蛋白、河豚毒素(TTX)、BaCl2和維拉帕米均為美國Sigam公司產品。

1.4實驗方法

1.4.1CHF模型制備：參照文獻[7]并作改良。CHF組和VOL組共20只兔，經耳緣靜脈推注異丙腎上腺素0.3mg/kg/天，連續注射3周(推注前后注意剃毛、消毒和止血)；Control組兔注射相同體積0.9% NaCl并作同樣處理，繼續飼養6個月后，觀察三組動物臨床癥狀，并行超聲心動圖和心電圖檢查。超聲心動圖和心電圖檢查由同一名副高級職稱專科醫師完成。結果：CHF兔出現消瘦、食欲減退、嗜睡、氣促和肌肉萎縮等臨床癥狀；超聲心動圖指標與Control組比較，左室射血分數降低(52.37±12.75% vs 85.21±15.58%)(P<0.01)，左室腔擴大29.46%，室間隔明顯變薄，左室短軸縮短率降低49.12%；心電圖出現室性早搏，與Control組比較心率變慢(231.07±27.32次/min vs 268.93±34.36次/min)(P<0.01)，QT間期延長(183.62±38.42ms vs 115.97±29.89ms)(P<0.01)。與CHF模型兔相關報道結果[6]一致，即20只家兔均造模成功，后隨機編入CHF組和VOL組，各10只，兩組在臨床表現、超聲心動圖和心動圖各參數比較均無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.4.2VOL干預方法：VOL組家兔在做完心室MAP參數后，間隔30min(消除心臟記憶對后續實驗數據的影響)，開始耳緣靜脈滴注VOL提取液20min(滴速為15滴/min)，之后維持該滴速記錄在體各項心電生理指標，直到實驗完成；對離體心室肌細胞ICa-L作用的VOL提取液干預時間是在細胞外液灌流心室肌細胞10min后通過灌注給予(灌流速度為3-5ml/min)，直到實驗結束。

1.5觀察指標

1.5.1在體左心室MAP：各組兔耳緣靜脈推注戊巴比妥鈉麻醉(300mg/kg)后開胸，用開瞼器撐開胸廓充分暴露心臟，剪開心包膜，用接觸式雙極鉑金微電極貼于左心室前壁靠近心尖部，記錄MAP心電信號。MAP心電信號經放大器放大、轉換和濾波后儲存于計算機，供測量、分析和統計實驗數據。觀察參數包括靜息膜電位(RMP)、動作電位幅度(APA)、動作電位最大上升速率(Maxdv/dt)、動作電位復極化恢復到10%、20%、50%、90%時程(APD10、APD20、APD50、APD90)。

1.5.2室性心律失常：MAP心電信號采集完成后30min(消除心臟記憶對后續實驗數據的影響)，采用短陣快速刺激法[7](Burst-pacing，波寬2ms，刺激時間10s)觀察各組誘發性室性心律失常(包括室性早搏、室性心動過速或心室顫動)的誘發率和心律失常持續時間，以及誘發各種心律失常的刺激周長(BCL)。

1.5.3心室肌細胞ICa-L及其電流-電壓(I-V)曲線： (1)分離心室肌細胞：上述實驗結束后，各組家兔經耳緣靜脈推注肝素鈉(500IU/kg)抗凝，10min后摘取心臟置于冰凍生理鹽水中，插入主動脈套管，連接離體心臟循環灌流裝置，先用無Ca2+Tyrode液逆行灌流，再用含Ⅰ型膠原酶、蛋白酶E和小牛血清白蛋白的無Ca2+Tyrode液循環灌流，最后用無Ca2+Tyrode液灌流。取下心臟去除心房肌、乳頭肌和浦肯野纖維等組織，留取心室肌制備單個心室肌細胞懸液，離心去上清，用含BSA和氨芐青霉素Tyrode調細胞濃度至5×105/ml，供膜片鉗實驗用。(2)分別將各組心室肌細胞懸液加到顯微鏡載物臺上的細胞記錄槽中，待細胞沉底貼壁，用細胞外液循環灌流10min。給予指令程序和記錄信號于膜片鉗軟件，并通過電極內液和玻璃微電極與細胞高阻抗封接，形成全細胞膜片鉗記錄模式。將鉗制電位設置為-40mV，指令電位由-40mV去極化到+60mV，躍階10mV，持續時間200ms，記錄一緩慢內向電流，然后灌流鈣通道阻滯劑維拉帕米(20μmol/L)10min，該緩慢內向電流減小，即為ICa-L。為消除Na+和K+電流的干擾，循環灌流細胞外液中加入TTX(50μmol/L)阻斷INa，加入 BaCl2(100μmol/L)阻斷IK1，記錄鉗制電位為+20mV時的ICa-L電流密度。對各組數據與描記圖形進行擬合，以鉗制電位為橫坐標，對應電流密度為縱坐標，繪制ICa-L的I-V曲線。為消除細胞大小對統計結果造成誤差，ICa-L用電流密度(pA/pF)表示。

1.6統計學處理

2　結　果

2.1各組心室肌MAP主要參數比較

RMP、APA、Maxdv/dt和各APD時程在Control組、CHF組和VOL組間差異均具有統計學意義(P<0.01)。與Control組比較，CHF組RMP、APA和Maxdv/dt明顯減少(t均≥10.65，均P<0.01)，各APD時程顯著延長(t均≥7.31，均P<0.01)；與CHF組比較，VOL組RMP、APA和Maxdv/dt明顯增加(t均≥7.92，P<0.01)，各APD時程均縮短(t均≥17.92，均P<0.01)。見表1。

表1　各組心室肌MAP主要參數比較(n均

注：與Control組比較，1)P<0.01；與CHF組比較，2)P<0.01

2.2各組誘發性室性心律失常指標比較

心律失常誘發率、持續時間分布、BCL和ICa-L在Control組、CHF組和VOL組間差異均有統計學意義(P<0.01)。與Control組比較，CHF組心律失常誘發率增加、心律失常持續時間延長(χ2均≥6.98，均P<0.01)，BCL也明顯延長(t=10.82，P<0.01)；與CHF組比較，VOL組心律失常誘發率降低，持續時間縮短(χ2均≥10.96，均P<0.01)。BCL縮短(t=5.851,P<0.01)。見表2。

表2　各組家兔誘發性室性心律失常相關指標比較(n均=10)

注：與Control組比較，1)P<0.01；與CHF組比較，2)P<0.01

2.3各組心室肌細胞ICa-L及I-V曲線

各組心室肌ICa-L電流密度差異有統計學意義(P<0.01)。與Control組比較，CHF組ICa-L電流密度顯著減小(t=8.64,P<0.01)，而VOL組較CHF組明顯增加(t=7.68,P<0.01)，見表2。各組于鉗制電位+20mV時，ICa-L電流密度最大，-40mV和+60mV時最低，呈明顯拋物線狀。各組I-V拋物線以Control組較高，CHF組明顯上抬，VOL組較CHF組顯著下移，接近Control組。見圖1。

3　討　論

CHF常引起心臟電重構，電活動紊亂，誘發嚴重室性心律失常[7]。本實驗建立的家兔CHF模型顯示，CHF發生后，其動作電位幅度降低，自動除極變緩，舒張速率低平、延長，復極化過程中各時間段均顯著延長；這些改變有利于CHF兔室性心律失常的發生。本文結果證實，CHF兔心臟在程控和短陣快速刺激下，誘發室性心律失常的BCL和持續時間均顯著延長，心室電明顯重構，誘發了室性心律失常。

CHF誘發室性心律失常易導致猝死風險，針對性藥物治療非常關鍵[8]。VOL具有增加心臟冠脈血流量、抗心肌缺血再灌注損傷和抗心律失常等作用。本研究表明，VOL可使CHF兔心臟APA增加，Maxdv/dt增快，APD顯著縮短，心室動作電位傳導速度和心率增加，從而增加CHF心輸出量和動能。而且VOL還能穩定心臟電活動，阻滯異位起搏點發放沖動，防止折返性室性心律失常的形成[9]。VOL能顯著縮短誘發CHF室性心律失常BCL，明顯降低心律失常發生率，即使發生室性心律失常，但持續時間也會變短，且易終止，或轉為竇性心率。進一步說明VOL可明顯降低CHF室性心律失常的敏感性閾值，增強抗額外快速刺激的耐受性，顯示抗CHF室性心律失常作用，與有關研究報道結果[10]相一致。心肌細胞動作電位平臺期的形成主要由ICa-L決定，它的開啟和關閉控制著動作電位傳導快慢和細胞中生理性[Ca2+]i變化[11]。Ca2+是心肌收縮原動力，其通過ICa-L進出細胞，產生動作電位傳遞的驅動力量[12]。當CHF心室肌細胞ICa-L下降，CHF心臟做功能力下降，電活動減弱，動作電位傳導減慢；反之，ICa-L增加時，CHF心臟的上述功能將會改善或加強。本研究中，CHF心室肌細胞ICa-L顯著減少，I-V曲線嚴重上抬，成為CHF心臟易發折返性室性心律失常的電生理表現。而VOL可以顯著增加CHF心室肌細胞的ICa-L，明顯下移I-V曲線，使心室肌細胞外Ca2+很快通過ICa-L進入心室肌細胞內，增加CHF心室肌細胞收縮動力和動作電位傳導速度，避免CHF心臟誘發折返性室性心律失常[13]。

圖1　各組心室肌細胞ICa-L的I-V曲線

總之，本次動物實驗表明VOL可明顯改善CHF兔心電生理指標，如縮短APD、BCL、降低心率失常發生率等，其機制可能與VOL增加CHF兔心肌細胞的ICa-L有關。該結果為臨床選擇應用VOL治療終末期CHF提供了實驗依據。

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本文第一作者簡介：

楊淑紅(1974-)，女，漢族，碩士，主管護師，主要從事心臟疾病的基礎研究

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Effect of Valeriana Officinalis L Extract on Correlated Electrophysiological Parameters of Ventricular Arrhythmias induced by Congestive Heart Failure in Rabbit

YANG Shu-hong1,CAO Hong2,HU He2,CHEN Yu-ting,XU Hui-wen

1Clinical Dressing Room;2Institute of Cardiovasallar Disease;3Department of Geriatrics,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To investigate effects of valeriana officinalis L extract (VOL) on correlated electrophysiological parameters of ventricular arrhythmias induced by congestive heart failure (CHF) in rabbits.Method:The male New Zealand rabbits (n=30) were divide into control,CHF and CHF+VOL (VOL) groups.The CHF models were induced by injection isoproterenol (0.3mg/Kg/d for 3 weeks),and control rabbits were injected 0.9% NaCl with same ways.The VOL group rabbits were injected 50mg/L VOL.The main cardioelectrophysiological parameters such as RMP,APA,Maxdv/dtand APD10-90,as well as basic cycle length (BCL),rate and time of induced arrhythmias by recording monophasic action potential (MAP) with Burst-pacing in rabbits in vivo with 50mg/L VOL administration.The L-type calcium current (ICa-L) was recorded via whole-cell patch clamp technique in enzymatically dissociated single rabbit ventricular myocytes.Results:Compared with control group,RMP,APA and Maxdv/dtwere significantly lowered,as well as APD10-90were notably lingered in CHF rabbit (Pof all <0.01,respectively).Compared with CHF group,VOL could significantlyincrease RMP,APA and Vmax,as well shorten APD10-90inVOL group in vivo (Pof all <0.01,respectively).Compared with control group,BCL and persistence time inducing ventricular arrhythmias were significantly lengthened,and occurrence of ventricular arrhythmias were obviously increased in CHF group (Pof all <0.01,respectively).However,VOL could obviously shorten BCL and persistence time of ventricular arrhythmias,and decrease rate of inducibility of ventricular arrhythmias with burst-pacing in VOL group in vivo (Pof all <0.01,respectively).VOL could markedly increase the current density of ICa-L,and alter down of current-voltage (I-V) relationship curve in different command potential in CHF ventricular myocytes.When command potential was +20mV,the current densities of ICa-Lwere significantly increased from (7.14±0.33)pA/pF in CHF group to (10.86±0.50)pA/pF in VOL group(P<0.01)with VOL administration.Conclusion:VOL could significantly decrease the vulnerability and susceptibility of ventricular arrhythmias induced by CHF,which was contributed to anti-ventricular arrhythmias induced by CHF.It is suggested that the mechanisms might attribute to that VOL could markedly increase ICa-Lin CHF rabbits.

Valeriana officinalis L extract; Congestive heart failure; Monophasic action potential; L-type cacium current; Anti-ventricular arrhythmias; Rabbit

湖北省自然科學基金(2011CDB504)；湖北省衛計委科研基金(JX6B67; WJ2015MB088)

單位]武漢大學人民醫院，武漢 430060；1外科門診；2心血管研究所；3老年病科

本文2016-05-30收到，2016-06-21修回

R541.7[文獻標識碼]A

1005-1740(2016)03-0011-05