抗人stathmin單克隆抗體和紫杉醇對肺癌細胞系QG-56的生長抑制和誘導凋亡作用*

阿里木江·賽提瓦爾地, 劉俊遠, 俞婷婷, 韓志剛

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 肺內一科(烏魯木齊　830011)

?

抗人stathmin單克隆抗體和紫杉醇對肺癌細胞系QG-56的生長抑制和誘導凋亡作用*

阿里木江·賽提瓦爾地, 劉俊遠, 俞婷婷, 韓志剛△

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 肺內一科(烏魯木齊830011)

目的探討抗人stathmin單克隆抗體(McAb)、紫杉醇(PTX)單用或聯合應用對肺癌細胞系QG-56的生長抑制及誘導凋亡作用。方法以不同濃度的抗人stathmin McAb、PTX分別組成McAb組、PTX組和聯合用藥組，另設不加藥的對照組，分別作用于QG-56細胞24、48、72、96 h，觀察細胞數量和形態的變化，MTT法檢測各組QG-56細胞的增殖抑制情況，采用流式細胞儀檢測各組QG-56細胞凋亡率。結果不同濃度的McAb組、PTX組和聯合用藥組細胞數量明顯減少、形態不規則，部分細胞核固縮和胞質減少，而對照組細胞生長狀態良好。抗人stathmin McAb、PTX單用和聯合應用均能抑制QG-56細胞增殖，呈劑量-時間依賴效應，聯合用藥組細胞抑制率較McAb組、PTX組明顯增大，差異有統計學意義(P<0.05)，兩藥聯用具有協同效應。抗人stathmin McAb、PTX單用與聯用均能誘導QG-56細胞凋亡，聯合用藥組誘導凋亡作用更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。結論抗人stathmin McAb、PTX單用與聯用均能抑制QG-56細胞增殖，誘導其凋亡，兩藥聯合作用于人肺癌QG-56細胞具有協同作用。

stathmin單克隆抗體; 紫杉醇; 肺癌; 增殖; 凋亡

肺癌是對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，化療是晚期肺癌的主要治療方法，但晚期肺癌患者對化療藥物的耐受性較差，目前靶向治療成為肺癌研究的熱點[1-2]。stathmin是近年來發現的腫瘤基因治療的新靶點，是細胞增殖和分化過程中至關重要的可溶性蛋白質，其高表達于多種惡性腫瘤患者[3]。研究[4-5]顯示，細胞內、外多種生物活性物質可與stathmin直接或間接作用，引起細胞生物學改變，控制細胞周期，改變細胞增殖、分化和活性等。紫杉醇(PTX)是目前世界公認的廣譜、強活性抗癌藥物，具有獨特的抗癌機理，尤其是對肺癌、卵巢癌、乳腺癌的治療有效率高達75%[6]。本研究旨在探討抗人stathmin單克隆抗體(McAb)與PTX單用或聯合應用對人肺癌QG-56細胞的生長抑制及誘導凋亡作用，現報道如下。

1　材料與方法

1.1細胞與主要試劑

人肺癌細胞系QG-56來自新疆醫科大學抗體工程研究所；PTX購于北京華素制藥股份有限公司；抗人stathmin McAb由新疆醫科大學抗體工程研究所制備；新生小牛血清、0.25%胰酶溶液、RPMI-1640培養液均購于美國Gibco公司；AnnexinV/ PI染色試劑盒購于深圳精美公司；噻唑藍(MTT)、分析純二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養將人肺癌細胞系QG-56接種于含10%胎牛血清、100 u/mL鏈霉素的IMDM培養基中，置于37 ℃、CO2濃度5%的孵育箱中培養。細胞為上皮樣細胞，對數生長期時每2～3 d傳代1次， 待細胞生長接近80%時收集并用于實驗操作。

1.2.2QG-56細胞形態變化觀察取對數生長期QG-56細胞，2×105/孔接種于6孔板，4 h后按加入成分的不同分為3組。 McAb組：加入不同濃度(10、20、40、80、160)μg/mL的抗人stathmin McAb；PTX組：加入不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6) μg/mL的PTX；聯合用藥組：同時加入不同濃度的抗人stathmin McAb和PTX(McAb 10 μg/mL+PTX 0.1 μg/mL、McAb 20 μg/mL+PTX 0.2 μg/mL、McAb 40 μg/mL+PTX 0.4 μg/mL、McAb 80 μg/mL+PTX 0.8 μg/mL、McAb 160 μg/mL+PTX 1.6 μg/mL)。另設不加藥的對照組。除對照組外，各組每一藥物濃度均設5個復孔，分別處理24、48、72、96 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.3MTT法檢測QG-56細胞增殖的抑制率取對數生長期QG-56細胞，5×103/孔接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養4 h后，按加入成分不同分為3組：McAb組，PTX組和聯合用藥組(加入藥物和藥物濃度同1.2.2)，另設不加藥的對照組。各組每一藥物濃度均設5個復孔。培養24、48、72、96 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培養4 h，棄上清，加入150 μL DMSO。采用酶標儀測各孔OD490nm，計算各組抑制率。抑制率(%)=(對照組OD490nm-實驗組OD490nm)/對照組OD490nm×100%。

1.2.4流式細胞術檢測QG-56細胞凋亡率取對數生長期QG-56細胞，2×105/孔接種于6孔板，4 h后按加入成分的不同分為3組：McAb組、PTX組及聯合用藥組(加入藥物和藥物濃度同1.2.2)，另設不加藥的對照組，各組每一藥物濃度均設4個復孔。用0.25%胰酶溶液收集培養24、48、72、96 h的樣本，加75%乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗2次，1 mg/mL RNase A 37 ℃消化30 min，100 μg/mL碘化丙啶4 ℃染色20 min。采用流式細胞儀分析，每組樣本計數分析104個細胞，最后應用ModFitl T V2.0軟件處理數據。

1.3統計學方法

2　結果

2.1各組QG-56細胞形態的改變

加藥前各組細胞數量、形態基本一致。培養48 h后，McAb組、PTX組及聯合用藥組細胞數量均減少，形態不規則，細胞核固縮，細胞質空泡或減少，細胞呈半懸浮狀態；對照組培養24、48、72、96 h后，細胞生長良好、細胞數量隨時間增加逐漸增多，細胞形態一致，染色質疏松，細胞質豐富。

2.2各組QG-56細胞的增殖抑制情況

2.2.1McAb、PTX對QG-56細胞的增殖抑制率

與陰性對照相比，McAb和PTX處理后QG-56細胞的增殖抑制率明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著濃度的增加和作用時間的延長，McAb和PTX對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，呈現時間(rMcAb=0.554，P=0.002；rPTX=0.492，P=0.001)和劑量(rMcAb=0.612，P=0.001；rPTX=0.591，P=0.001)依賴趨勢(表1和表2)。

2.2.2McAb聯合PTX對QG-56細胞的增殖抑制率聯合用藥組對QG-56細胞增殖的抑制作用較McAb組和PTX組單藥處理時明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)，析因方差分析顯示，兩藥聯用呈現交互效應，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表1　McAb對QG-56細胞增殖的抑制作用

表2　單用紫杉醇對QG-56細胞增殖的抑制作用±s)

表3　McAb和PTX聯用對QG-56細胞增殖的抑制作用

2.3各組QG-56細胞凋亡率比較

聯合用藥組出現不同程度的細胞凋亡增加，且呈時間(r=0.576，P=0.001)和劑量(r=0.634，P=0.001)依賴趨勢。同一時間點和不同濃度組間凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；同一藥物濃度和不同時間點凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與McAb組、PTX組比較，聯合用藥組細胞凋亡率較高，差異有統計學意義(P<0.05)(表4～表6)。

表4　McAb作用后QG-56細胞凋亡率的改變

表5　PTX作用后QG-56細胞凋亡率的改變

表6　McAb和PTX單用或聯用后QG-56細胞凋亡率的改變

3　討論

肺癌是目前全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，約2/3的患者確診時已屬中晚期，失去了手術治療的機會。化療為晚期肺癌的主要治療方法，但隨著治療時間的延長，患者對化療藥物耐受性減弱，化療效果不理想[7]。隨著藥物遺傳學和基因學的迅速發展，研究[8]發現，腫瘤組織中的基因表達與腫瘤化療療效密切相關。因此，依據腫瘤患者組織中基因表達情況，采用靶向治療策略提高腫瘤患者化療效果，減少毒副反應成為新的治療思路。

stathmin是從淋巴瘤中篩選的特征性基因的表達產物，屬于高度保守的胞質磷蛋白，可在細胞周期的不同階段通過其磷酸化和去磷酸化作用對細胞的維管系統動態平衡的調節發揮重要作用，高效調節細胞的增殖與分化[9]。stathmin在多種惡性腫瘤組織中均有高水平表達，為腫瘤基因治療提供了一個新的靶點，通過靶向治療，抑制其表達可干擾惡性腫瘤細胞的有絲分裂，從而影響腫瘤細胞的增殖[10]。研究[11-12]報道，stathmin的高水平表達是惡性腫瘤細胞維持高增殖率和轉化表型所必須的，抑制stathmin基因表達，不僅能逆轉惡性腫瘤表型，還可抑制腫瘤細胞增殖。紫杉醇是目前唯一一種具有獨特抗微管作用機制的天然抗癌藥物，主要從紫衫的樹干和樹枝中提取而成，不僅能促進微管聚合，形成穩定的微管聚合物，顯著減少游離的微管數量，抑制細胞有絲分裂，還能抑制細胞增殖，最終導致癌細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，PTX和抗人stathmin McAb單用或聯合應用均可明顯抑制QG-56的增殖，誘導其凋亡，且增殖抑制作用和誘導凋亡作用均呈時間-劑量依賴關系；此外，兩藥聯用比單用時的增殖抑制作用、誘導凋亡作用更明顯，提示兩藥對肺癌細胞存在協同抑制作用。與原少斐等[14-15]研究報道相似，提示抗人stathmin McAb聯合PTX治療肺癌具有明顯優勢。

綜上所述，抗人stathmin McAb、PTX單用與聯用均能抑制QG-56細胞增殖，誘導其凋亡，兩藥聯合應用對人肺癌QG-56細胞具有協同抑制作用，不僅為肺癌患者體內研究提供了基礎和依據，還提供了新的研究思路和治療方案，提示抗人stathmin McAb聯合PTX應用具有良好的應用前景。

[1]薛洪省, 周少華, 盧萬鵬, 等. 非小細胞肺癌靶向治療的靶點研究進展[J]. 中國肺癌雜志, 2013, 16(2): 107-113.

[2]Li T, Kung HJ, Mack PC,etal. Genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer: implications for current and future therapies[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(8): 1039-1049.

[3]Jeon TY，Han ME，Lee YW，etal． Overexpression of stathmin1 in the diffuse type of gastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells[J]. Br J Cancer, 2010, 102(4): 710-718.

[4]趙楠, 韓波, 吳宗勇, 等. 食管鱗癌患者血清Stathmin的表達及臨床意義[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22(14): 2016-2022.

[5]Miceli C, Tejada A, Castaneda A,etal. Cell cycle inhibition therapy that targets stathmin in in vitro and in vivo models of breast cancer[J]. Cancer Gene Ther, 2013, 20(5): 298-307.

[6]Yu J, Lee HJ, Hur K,etal. The antitumor effect of a thermosensitive polymeric hydrogel containing paclitaxel in a peritoneal caicinomatosis model[J]. Invest New Drugs, 2012, 30(1): 1-7.

[7]陸建榮, 陳敬信, 丁彩霞, 等. Stathmin在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義[J]. 現代腫瘤醫學, 2014, 22(10): 2359-2361.

[8]蒲驍麟, 王峻, 許林, 等. β-tubulin-Ⅲ和Stathmin與晚期非小細胞肺癌化療敏感性的關系[J]. 中國肺癌雜志, 2009, 12(1): 49-53.

[9]Belletti B, Baladssarre G. Stathmin: a protein with many tasks. New biomarker and potential target in cancer[J]. Expert Opin Ther Targets, 2011, 15(11): 1249-1266.

[10] Nouar R, Devred F, Breuzard G,etal. FRET and FRAP imaging: approaches to characterise tau and stathmin interactions with microtubules in cells[J]. Biol Cell, 2013, 105(4): 149-161.

[11] 李雪, 李建鵬, 哈敏文. Stathmin在非小細胞肺癌中表達增強[J]. 基礎醫學與臨床, 2011, 31(10): 1115-1119.

[12] Wu Y, Tang M, Wu Y,etal. A combination of paclitaxel and siRNA-mediated silencing of Stathmin inhibits growth and promotes apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cell Oncol (Dordr), 2014, 37(1): 53-67.

[13] Cho H, Cho CS, Indig GL,etal. Polymeric micelles for apoptosis-targeted optical imaging of cancer and intraoperative surgical guidance[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e89968.

[14] 原少斐, 陳筱婷,汪森明,等.抗人微管不穩定蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 腫瘤防治研究, 2009, 36(6): 466-469.

[15] 原少斐, 杜紅延, 陳筱婷, 等. 抗人stathmin單克隆抗體與紫杉醇連用對人肝癌細胞增殖的抑制作用[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2009, 16(2): 165-169.

Effect of Anti-human Stathmin Monoclonal Antibody and Paclitaxel on the Growth Inhibition and Inducing Apoptosis of Lung Cancer Cell Line QG-56

AlimijiangSaitiwaerdi,LiuJunyuan,YuTingting,HanZhigang△.

FirstDepartmentofInternalMedicineforLung,TheAffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830011,China

ObjectiveTo explore the effect of anti-human stathmin monoclonal antibody (McAb) and paclitaxel (PTX) in single or combined application on the growth inhibition and inducing apoptosis of lung cancer cell line QG-56. MethodsThe single drug group and the combined drug group were set according to the different concentrations of anti-human stathmin McAb and PTX respectively, while the control group received no drugs. The drugs were used on QG-56 cells for 24, 48, 72 and 96 hours respectively to observe the changes of cell count and morphology. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the proliferation and inhibition of QG-56 cells, while flow cytometry (FCM) was adopted to detect the apoptotic rate of QG-56 cells. ResultsThe cell count reduced significantly, the morphology was irregular, and the partial karyopyknosis and cytoplasm decreased in the single drug group and the combined drug group with different concentration of drugs, while cells had favorable growth conditions in the control group. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both inhibit the proliferation of QG-56 cells at a dosage-time-dependent manner. However, the combined drug group was significantly better in the inhibition rate of cells than the single drug groups (P<0.05), and the combination of two drugs had synergistic effect. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combined drug group was more significant in inducing apoptosis (P<0.05). ConclusionAnti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combination of two drugs has a synergistic effect on human lung cancer QG-56 cells.

Stathmin monoclonal antibody; Paclitaxel; Lung cancer; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.010

中國高校醫學期刊臨床專項資金(No:11522538)

韓志剛，E-mail: 1378213986@qq.com

R734.2

A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.0959.004.html