RDG修飾共載多烯紫杉醇和蘇拉明脂質體乳腺癌靶向治療研究

郭發爽

(解放軍159中心醫院 乳腺外科　河南 駐馬店　463000)

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RDG修飾共載多烯紫杉醇和蘇拉明脂質體乳腺癌靶向治療研究

郭發爽

(解放軍159中心醫院 乳腺外科河南 駐馬店463000)

目的探討RDG修飾共載多烯紫杉醇(DOC)和蘇拉明(Su)脂質體(RDGLP-DOC/Su)對乳腺癌的靶向治療價值。方法采用薄膜分散法制備RDGLP-DOC/Su，并同時制備RGD修飾蘇拉明脂質體(RGDLP-Su)、RGD修飾多烯紫杉醇脂質體(RGDLP-DOC)，采用MMT法檢測HUVEC細胞和MCF-7細胞在不同脂質體中的增殖，采用流式細胞術檢測不同脂質體中細胞的攝取量。結果RGDLP中腫瘤細胞攝取量明顯高于普通脂質體(P<0.05)；RGDLP-DOC/Su對于乳腺癌細胞MCF-7、HUVEC的增殖抑制具有交互作用，明顯高于RGDLP-Su、RGDLP-DOC(P<0.05)。結論RGDLP-DOC/Su可有效抑制乳腺腫瘤生長和細胞增殖，具有較強的靶向治療效果，可作為今后腫瘤靶向治療的研究方向。

乳腺腫瘤；脂質體；多烯紫杉醇；蘇拉明

靶向血管抗腫瘤是近年來新興的一種腫瘤治療方法，通過阻斷瘤體血管進而造成腫瘤細胞氧氣和營養供應不足，使其缺血壞死[1]。蘇拉明(Su)和多烯紫杉醇(DOC)均是常用的抗腫瘤藥物，但單獨應用對于腫瘤的殺傷效果較為有限。臨床研究指出，腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞均存在整合素受體的高度表達[2]。本研究通過制備RGDLP-DOC/Su脂質體并進行相關分析，旨在為乳腺癌靶向治療提供可靠的參考依據。

1　材料與方法

1.1動物模型及細胞本研究中HUVEC血管內皮細胞由上海細胞研究所提供，MCF-7乳腺癌細胞由ATCC提供。由本地實驗動物公司提供雌性裸鼠模型58只，周齡為4～6周，體質量為21～26 g，動物合格證號為2013001619132。

1.2主要試劑DMEM培養基和胎牛血清由賽默飛世爾生物化學制品有限公司提供，DOC(99.7%，產品批號為S05055)由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，Su(98.0%，產品批號為A0272256)由Sigma公司提供，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)由上海吉爾生化公司提供。

1.3脂質體制備參照Guo J等提出的方法進行RGD-PEG2000-DSPE合成，取Su 0.30 mg，DOC 0.33 mg，RGD-PEG2000-DSPE 1.10 mg，膽固醇0.96 mg，大豆磷脂12.05 mg，在氯仿中溶解，并于茄型瓶中進行減壓蒸餾，制備成膜，將有機溶劑去除，在充分干燥后同PBS 1 ml混合后水化，以(80 W，10 s，5次)超聲制成RGDLP-DOC/Su，使用相同方法制備RGDLP-DOC和RGDLP-Su脂質體。

1.4細胞攝取測試按照5×105/孔密度進行對數生長期細胞接種，培養后取適量普通脂質體和RGDLP加入孔中，維持孔中脂質體濃度在0.2 mg/ml。孵育后將脂質體培養基去除，使用冷PBS進行清洗，并以0.25%胰酶進行消化，離心后使用流式細胞儀進行細胞熒光值測定。將細胞與脂質體共同孵育4 h，觀察脂質體的細胞攝取情況，使用PBS對細胞進行漂洗，同DAPI 2 μg/ml混合，在室溫下孵育20 min，使用冰PBS漂洗3次，取4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，使用冰PBS保存。在激光共聚焦熒光倒置顯微鏡中觀察細胞攝取情況。

1.5細胞抑制檢測使用胰酶對MCF-7細胞進行消化，高速離心后置于DMEM培養液中，調節濃度至5×107/ml。取制備好的MCF-7細胞懸濁液進行裸鼠背部接種，接種成功后，將裸鼠隨機分為PBS組、RGDLP-DOC組、RGDLP-Su組、RGDLP-DOC/S組，于腫瘤生長21 d后，取下腫瘤并稱取體質量，計算生長抑制率。

2　結果

2.1生長抑制RGDLP-DOC、RGDLP-Su對于乳腺癌細胞MCF-7、HUVEC的生長抑制率差異無統計學意義(P>0.05)，但RGDLP-DOC/Su對于乳腺癌細胞MCF-7、HUVEC的增殖抑制具有交互作用，明顯高于RGDLP-Su、RGDLP-DOC，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　不同脂質體對乳腺腫瘤細胞的生長抑制情況(%)

2.2 細胞攝取細胞攝取定量檢測顯示，RGDLP中MCF-7細胞攝取量為(68.2±2.6)，HUVEC細胞攝取量為(15 041±5.8)；普通脂質體中MCF-7細胞攝取量為(28.3±1.7)，HUVEC細胞攝取量為(50.1±3.7)，RGDLP中腫瘤細胞攝取量明顯高于普通脂質體，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

脂質體是一種雙層膜球形結構，其成分以磷脂為主。臨床研究指出，腫瘤內皮血管表面和腫瘤細胞均存在大量整合素受體的表達，RGD作為一種環狀三鈦，可同整合素受體特異性結合[3]。本次研究中，將RGD同Su、DOC脂質體表面相結合，對乳腺腫瘤新生血管和癌細胞進行靶向抑制。王曉珊等[4]研究指出，在RGD修飾脂質體上進行DOC和Su聯合包載可有效提高腫瘤血管細胞和腫瘤細胞對脂質體的攝取。RGD修飾脂質體中腫瘤細胞攝取率明顯高于普通脂質體，同相關報道中的結論基本一致[5]，提示采用RGD修飾脂質體對Su和DOC進行包載后，可促進抗腫瘤藥物介導性的顯著提高。對于解決腫瘤內部血管少且壓力高，給藥系統無法深入問題具有十分積極的作用。

為進一步證實RGDLP-DOC/Su對于乳腺癌的靶向治療作用，本研究結果顯示， RGDLP-Su、RGDLP-DOC脂質體對于乳腺癌細胞增殖的抑制效果較為有限。在RGDLP-DOC/Su脂質體中，乳腺癌細胞生長抑制率高達80%以上。一方面證實RGD修飾脂質體可有效增強抗腫瘤藥物的靶向治療效果，另一方面提示抗血管藥物Su和細胞毒性藥物DOC連用可有效增強腫瘤治療效果。

綜上所述，RGDLP-DOC/Su可有效抑制乳腺腫瘤生長和細胞增殖，具有較強的靶向治療效果，可作為今后腫瘤靶向治療的研究方向。

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[3]柳青.多烯紫杉醇對乳腺癌細胞T47D增殖與凋亡的影響及其機制研究[J].四川生理科學雜志,2015,37(4):168-170.

[4]王曉珊,黃艷,劉迪,等.RGD修飾共載多烯紫杉醇和蘇拉明脂質體乳腺癌靶向治療研究[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(22):1783-1787.

[5]楊泳,張家衡.多烯紫杉醇、吉西他濱聯合順鉑序貫治療轉移復發性乳腺癌臨床觀察[J].海南醫學院學報,2013,19(11):1558-1561.

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.08.045

2016-03-10)