碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥機制研究

林伯熹， 李 彬， 劉秀琴， 徐小紅， 曹穎平

·論著·

碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥機制研究

林伯熹1，2， 李 彬1， 劉秀琴1， 徐小紅1， 曹穎平1，2

目的 研究碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的耐藥機制。方法 收集福建醫科大學附屬協和醫院2011年8月-2012 年8月的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，采用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗；改良Hodge試驗篩查菌株是否產碳青霉烯酶；利用PCR擴增碳青霉烯酶基因（KPC、IMP、VIM、NDM）及其他β內酰胺酶基因（SHV、TEM、CTX-M-1組、CTX-M-2組、CTX-M-9組）；利用腸桿菌基因重復一致序列分析（ERIC-PCR）進行菌株同源性分析；通過接合試驗驗證碳青霉烯酶基因是否能水平轉移。結果 共收集29株陰溝腸桿菌，藥敏結果顯示對檢測抗菌藥物耐藥率＞90 %的有3種，分別為頭孢他啶（93.1 %）、頭孢西丁（100 %）和氨曲南（93.1 %）；多黏菌素B耐藥率最低為3.4 %。改良Hodge試驗陽性率為79.3 % （23/29）。29株實驗菌共檢出23株含有β內酰胺酶基因，其中IMP基因陽性17株、KPC基因陽性1株。29株陰溝腸桿菌可分為23個不同的型別，其中1株未能分型。接合試驗成功率48.3 %（14/29）。結論 該院碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌攜帶碳青霉烯酶基因，以IMP基因較常見。

陰溝腸桿菌； 碳青霉烯酶； 金屬酶IMP； 耐藥機制

陰溝腸桿菌是臨床上重要的感染病原體，常對多種抗菌藥物耐藥，引起難治性感染［1］。其耐藥機制主要由產生β內酰胺酶引起，如產ESBL 和AmpC。新一代的碳青霉烯類抗生素憑借其良好的抗菌活性，對產ESBL和AmpC的革蘭陰性桿菌有很強的治療效果。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛應用，新型的耐藥菌開始出現。2003年JEONG等［2］報道了產VIM-2型金屬酶的陰溝腸桿菌，使碳青霉烯類耐藥的陰溝腸桿菌開始受到廣泛的關注。之后， 很多文獻報道了攜帶碳青霉烯酶基因（如IMP、KPC、VIM、NDM）的陰溝腸桿菌［3-5］，且此類細菌往往同時攜帶有其他β內酰胺酶基因，這使得臨床出現越來越多的多重耐藥菌。本實驗對碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌進行耐藥機制的研究，旨在為臨床治療該菌感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2011年8月-2012年8月福建醫科大學附屬協和醫院臨床分離出對亞胺培南和厄他培南2種藥物出現任一種耐藥的陰溝腸桿菌29株，剔除同一患者同一部位的重復菌株。細菌培養標本包括痰、膿液、尿液、膽汁等。菌株均用法國生物梅里埃公司的全自動微生物分析系統VITEK-2 Compact進行鑒定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 儀器與試劑 MH瓊脂、伊紅亞甲藍瓊脂、亞胺培南、厄他培南紙片10 μg均購自杭州天和微生物試劑有限公司，dNTP Mix（10 mmol/L）、TaqDNA聚合酶（5 U/μg）、Loading Buffer（6×）均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司，基因擴增引物、瓊脂糖、Maker（100～1 500 bp）均購自上海生工生物工程技術服務有限公司，PCR擴增儀和凝膠成像分析系統為美國BIO-RAD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗。藥敏試驗所用抗菌藥物分別購于杭州默沙東制藥有限公司、中國藥品生物制品檢定研究所、惠氏制藥有限公司。制備0.5麥氏濁度的菌懸液，然后1∶10稀釋，使用移液槍吸取制備好的菌液（約1～2 μL）接種于瓊脂平皿表面，每點菌量約為104CFU/點，形成直徑大約為5～8 mm的菌斑，待菌液被瓊脂吸收后置35℃溫箱孵育16～20 h，將平皿置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，獲取藥物的MIC值，判斷標準參照CLSI 2011年版［6］。

1.2.2 改良Hodge試驗 用此法進行碳青霉烯酶表型篩查。配制0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC25922的菌懸液，然后將其稀釋10倍后均勻涂布在MH平皿上，室溫放置待菌液吸收后，于平皿中間貼厄他培南（10 μg）紙片，而后用接種環挑取3～5個過夜生長的實驗菌株以厄他培南紙片為起點，沿離心方向劃線長度20～25 mm，置35 ℃溫箱孵育16～20 h；如果受試菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌圈交匯處，大腸埃希菌生長增強，即為產碳青霉烯酶［6］。

1.2.3 β內酰胺酶基因的檢測 采用PCR法擴增常見的β內酰胺酶基因，包括TEM、SHV、CTXM-1組、CTX-M-2組、CTX-M-9組 以 及KPC、IMP、VIM、NDM。煮沸法制備PCR模板，引物序列見表1。反應體系為：總體積50 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）0.4 μL，PCR Buffer （Mg2+Free） 5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，無菌水38.35 μL，模板DNA 1 μL。熱循環參數：94 ℃預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經2 %瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，選取與目的片段大小一致的PCR陽性產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，根據所測序列與GenBank中BLAST程序中的序列比對，確定所測細菌耐藥基因的基因型。

1.2.4 接合試驗 本實驗利用LB液相接合方法，受體菌為大腸埃希菌J53 Azr（對疊氮鈉耐藥）。挑取供體菌和受體菌單個菌落分別接種于2 mL LB肉湯中，35 ℃搖床180 r/min孵育4 h。取0.5 mL的供體菌和受體菌菌液混合于另一管4 mL LB肉湯中，溫箱中35 ℃溫箱靜置孵育18 h。取0.1 mL的混合菌液涂布于含100 mg/L的疊氮鈉和1 mg/L頭孢噻肟的MH瓊脂平皿上，同時將受體菌和供體菌株等量涂布于篩選平皿上做對照，35 ℃溫箱孵育過夜。挑取單個克隆，制備DNA模板用PCR進行陽性接合子的驗證。

1.2.5 菌株同源性分析 利用腸桿菌基因重復一致序列分析（ERIC-PCR）對受試菌進行同源性分析。采用煮沸法提取細菌總DNA作為模板，引物序列為ERIC-F：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，ERIC-R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。反應體系同1.2.3。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、26 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，共4個循環；94 ℃變性30 s、40 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共40個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經2 %瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。理論上，具有同源性的菌株應有相同的主帶，且副帶差異不多于3條［16］。

表1 所用PCR引物序列Table 1 The primers and corresponding sequence used in PCR

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

結果顯示，對β內酰胺類抗生素耐藥率達50%以上；對3種碳青霉烯類抗生素的耐藥率由高到低依次為厄他培南、亞胺培南、美羅培南。藥敏結果見表2。

表2 29株碳青霉烯耐藥陰溝腸桿菌對17種抗菌藥物的耐藥率Table 2 Susceptibility of 29 strains of carbapenem-resistant Enterobacter cloacae to 17 antimicrobial agents

表2（續）Table 2（continued）

2.2 改良Hodge試驗

29株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌中，23株改良Hodge試驗陽性，包括21株強陽性和2株弱陽性，6株陰性，陽性率為79.3 %，見圖1。

圖1 改良Hodge試驗結果圖Figure 1 The modified Hodge test

2.3 β內酰胺酶基因檢測結果

2.3.1 碳青霉烯酶基因檢測結果 29株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌中，18株菌檢出碳青霉烯酶基因（6株IMP-8、11株IMP-4、1株KPC-2），結果見表3。

表3 29株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥基因陽性率Table 3 The resistance genes identified in 29 strains of carbapenem-resistant Enterobacter cloacae

2.3.2 其他β內酰胺酶基因檢測結果 29株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌中21株菌攜帶其他β內酰胺酶基因，結果見表3，電泳圖見圖2。檢出了CTX-M-1組基因3株（CTX-M-3型2株和CTXM-22型1株），檢出了CTX-M-9組基因1株為CTX-M-14型；13株攜帶TEM基因，均為TEM-1基因型；14株攜帶SHV基因（SHV-12型12株和SHV-11型2株）。在IMP基因陽性的菌株中同時攜帶其他β內酰胺酶基因的占94.1%（16/17）。

圖2 碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌耐藥基因PCR電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of the PCR products of resistance genes in carbapenem-resistant Enterobacter cloacae

2.4 接合試驗結果

對能在選擇性平皿上生長的細菌通過耐藥基因PCR和ERIC-PCR進行驗證。篩選的接合子與供體菌具有相同的碳青霉烯酶基因；且ERIC-PCR結果顯示篩選的接合子與受體菌屬于同一型。本研究收集的29株陰溝腸桿菌中有14株（IMP型8株，KPC型1株，其他型5株）接合成功，接合率達48.3%。

2.5 菌株同源性分析結果

根據ERIC-PCR結果分析，29株陰溝腸桿菌可分為23個不同的型別，其中1株未能分型。電泳圖見圖3。

圖3 部分實驗菌ERIC-PCR電泳圖Figure 3 Electrophoretogram of ERIC-PCR products of some carbapenem-resistant Enterobacter cloacae strains

3 討論

陰溝腸桿菌是臨床上常見的引起感染的革蘭陰性桿菌，因其能引起人體多器官、多部位的感染而被臨床重視。現今臨床上出現越來越多的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，引起難治性感染［3-4］。

從藥敏結果中顯示，大多數受試菌為多重耐藥菌，且對多種抗生素都產生了高水平的耐藥，頭孢西丁、頭孢他啶、氨曲南對受試菌幾乎無作用，受試菌對頭孢吡肟的耐藥率也超過了50 %，造成這種情況的原因可能與抗菌藥物過度使用密切相關，臨床抗感染時應酌情使用這些藥物。該菌對多黏菌素B耐藥率為3.4 %，但高毒性使其在臨床上的應用受到一定限制。另外，阿米卡星的耐藥率很低（10.3 %），與其他文獻相似［17-19］。此外，左氧氟沙星對實驗菌也有較好的抗菌活性，是因為氟喹諾酮類抗菌藥物是全人工合成，其特有的分子結構少有天然耐藥和交叉耐藥的存在［20］。同時，本研究還發現，同屬碳青霉烯類藥物的亞胺培南、厄他培南的耐藥率（＞50 %）高于美羅培南，可能原因是亞胺培南較早應用在臨床，而且美羅培南的抗菌作用靶位為PBP2和PBP3而亞胺培南的抗菌作用靶位僅為PBP2［21］；而細菌的外膜相關機制是引起厄他培南耐藥的重要原因［22］，這可以解釋本研究中厄他培南耐藥率高于美羅培南。

改良Hodge試驗的假陽性可由菌株攜帶并表達高水平的ESBL（如CTX-M，尤其是CTXM-2、CTX-M-15、CTX-M-59）和（或）AmpC酶、細菌外膜蛋白的缺失等機制引起［23-24］。本試驗中，有6株假陽性菌株，其中4株攜帶有CTX-M基因；2株假陽性菌株未檢出ESBL或AmpC酶基因，可能由于外膜蛋白缺失的原因［23］。另外，本研究檢出1株攜帶IMP-4基因的假陰性菌株，可能由于細菌水解酶的表達水平不高所致。據DOYLE等［25］報道，改良Hodge試驗在檢測KPC型和OXA型碳青霉烯酶時具有良好的效果，但對金屬酶IMP、VIM、NDM-1檢測效果并不明顯。

本實驗中在陰溝腸桿菌中檢出攜帶有IMP和KPC的菌株，與以往研究多次報道類似［26-28］，且在各地都有相關的報道［3-5］。雖然沒有出現大范圍暴發的情況，但考慮到其通過質粒傳播的可能性，應引起足夠的重視。

耐藥基因能夠通過細菌的可移動序列實現跨菌種之間傳播，這也是近年腸桿菌科細菌碳青霉烯類藥物耐藥增多的原因之一［29］。本實驗中陰溝腸桿菌接合成功率較高（48.3 %）。通過接合試驗證明了IMP及KPC基因發生水平轉移可能性。通過ERIC-PCR，29株陰溝腸桿菌可被分為23個型別，尚未發現明顯的克隆性傳播。可以認為本實驗收集的菌株來自不同的克隆個體，耐藥菌株可能通過水平傳播機制將耐藥基因傳給原本敏感的細菌。

腸桿菌科細菌常攜帶有ESBL和AmpC酶，所以碳青霉烯類抗生素在腸桿菌科細菌感染的治療中起很大的作用。但從本次研究結果可以看出，福建醫科大學附屬協和醫院收集的陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥，為避免出現耐藥菌的播散及耐藥譜的擴大，臨床及實驗室應建立起本地區的碳青酶烯類耐藥細菌情況調查及適合的檢測體系，為防控提供客觀依據。

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Study on the resistance mechanisms of carbapenem-resistant Enterobacter cloacae

LIN Boxi， LI Bin， LIU Xiuqin， XU Xiaohong， CAO Yingping. （Department of Laboratory Medicine， Fujian Medical University Union Hospital， Fuzhou 350001， China）

Objective To investigate the antibiotic resistance mechanisms of carbapenem-resistant Enterobacter cloacae. Methods The modified Hodge test was used for detection of carbapenemase production. The minimum inhibitory concentrations （MICs） were determined using agar dilution method. Carbapenem-resistant genes （KPC， IMP， VIM， NDM） and other β-lactamase genes （SHV， TEM， CTX-M-1 group， CTX-M-2 group and CTX-M-9 group） were analyzed by PCR and sequencing. Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction （ERIC-PCR） was used to evaluate the genetic similarity between the isolates. A conjugation experiment was performed using broth mating technique. Results A total of 29 isolates were included in this study. Antimicrobial susceptibility testing showed that more than 90% of the strains were resistant to ceftazidime， cefoxitin and aztreonam. The modified Hodge test was positive for 79.3% （23/29） of the isolates. PCR demonstrated a high prevalence （62.1%， 18/29） of carbapenemases in Enterobacter cloacae. IMP-4， IMP-8， and KPC-2 were identified in 11 （37.9%）， 6 （20.7%）， 1 （3.4%） isolates，respectively. Overall， 28 of the 29 isolates belonged to 23 different types. The remaining one strain was nontypeable. Conjugation experiment was successful for 48.3% （14/29） of the isolates. Conclusions IMPs are the dominant genotypes in the carbapenem-resistant Enterobacter cloacae in our hospital.

Enterobacter cloacae； carbapenemase； IMP metallo-beta-lactamase； mechanism of antibiotic resistance

R378.2

A

1009-7708（2016）02-0194-06

10.16718/j.1009-7708.2016.02.0012

2015-04-17

2015-11-11

國家自然科學基金（81201328、81171656）；福建省高校杰青項目（JA13134）；福建省衛計委中青年骨干人才培養項目（2015-ZQN-ZD-15）。

1. 福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科，福州 350001；2. 福建醫科大學協和臨床醫學院。

林伯熹（1989—），男，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制研究。

曹穎平，E-mail： caoyingping@aliyun.com。