基質輔助激光解析電離飛行時間質譜在革蘭陰性桿菌對β內酰胺類抗生素耐藥性檢測中的應用進展

李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

·綜述·

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜在革蘭陰性桿菌對β內酰胺類抗生素耐藥性檢測中的應用進展

李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜； 革蘭陰性桿菌； β內酰胺類抗生素； 耐藥性

β內酰胺類抗生素是一類臨床應用最為廣泛的抗菌藥物，它通過干擾細菌細胞壁肽聚糖的交聯結構發揮殺菌作用。該類抗生素包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環類和碳青霉烯類等，其中尤以碳青霉烯類抗生素的抗菌活性最強。2013年CHINET細菌耐藥性監測數據顯示：腸桿菌科細菌對頭孢菌素的耐藥率約為20%，對碳青霉烯類抗生素的耐藥率接近7%；不發酵糖革蘭陰性桿菌對頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素耐藥率均接近50%［1］。耐藥菌株不斷出現給臨床用藥的選擇帶來很大困惑。針對上述細菌耐藥性的嚴峻形勢，需要應用新技術更加快速、準確地檢測細菌及其對抗菌藥物的耐藥性，從而及時對患者進行合理的抗生素治療，對醫院內傳播的耐藥菌株采取有效的控制措施。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是最新發展起來的一種快速檢測生物大分子的軟電離質譜技術，可用于細菌和真菌鑒定，具有簡便、快速、準確和經濟等優點［2］。近年來MALDI-TOF MS技術在微生物領域內的應用范圍不斷擴展，它不僅是細菌鑒定的有效工具，也為細菌耐藥性檢測研究提供了新方法。細菌對抗生素產生耐藥性的原因包括：天然固有耐藥、后天耐藥基因突變和基因轉移。革蘭陰性桿菌對β內酰胺類抗生素產生的耐藥機制主要有以下3種：產β內酰胺酶、外膜孔道蛋白結構改變和外排泵系統的過度表達等。本文從上述三方面綜述了MALDI-TOF MS在革蘭陰性桿菌β內酰胺類抗生素耐藥性檢測方面相關的研究進展，并展望該技術未來的應用前景。

1 應用MALDI-TOF MS檢測β內酰胺酶

1.1 β內酰胺酶活性的檢測

產β內酰胺酶是導致細菌對β內酰胺類抗生素耐藥的主要原因，臨床上重要的β內酰胺酶包括青霉素酶、超廣譜β內酰胺酶（ESBL）、頭孢菌素酶以及碳青霉烯酶。β內酰胺酶具有解開β內酰胺類抗生素的β內酰胺環的活性，應用MALDI-TOF MS檢測抗生素及其降解產物變化，可以判斷細菌是否具有β內酰胺酶活性。常見β內酰胺類抗生素及其降解產物的分子式和分子量見表1。

表1 β內酰胺類抗生素及其降解產物的分子式和分子量

應用MALDI-TOF MS檢測抗生素等小分子樣本的常用基質有2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）［3］，分子量分別為154 u和190 u。由于基質的質譜峰可能會干擾待測抗生素的質譜峰，因此需要選擇合適的基質，使基質峰和樣品峰之間不存在重疊。相關研究顯示：美羅培南［M+H］+（384 u）與HCCA二聚物［2M+H］+（380 u）的質譜峰有重疊，應選擇DHB為檢測美羅培南的基質［4］；檢測氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南和厄他培南等抗生素，均可選擇HCCA為基質［5-7］。應用MALDI-TOF MS檢測細菌的β內酰胺酶活性，可用Tris-HCl緩沖液和0.45% NaCl溶液作為細菌蛋白質的溶劑，其中加入SDS能有效降低上清液中細菌蛋白豐度，抑制基質信號，從而提高檢測特異性［4，8］。目前市場上已有多種品牌及型號的MALDI-TOF MS儀和靶板：質譜儀通常配制MALDI離子源和線性TOF檢測器，采用新型的反射式TOF檢測器，能提高檢測分辨率和質譜數據采集速度；AnchorChip質譜靶板表面疏水作用基團的中央具有親水基團，溶劑蒸發時樣品液滴收縮增加了靶板點樣區的蛋白質豐度，相對常規靶板其檢測靈敏度提高10～100倍［6］。

不同文獻報道的應用MALDI-TOF MS檢測β內酰胺酶活性的方法基本相同：將過夜培養的純菌落配成菌懸液，加入一定濃度的β內酰胺類抗生素溶液，混勻后置于37 ℃孵育1～4 h，離心，取上清液和相應基質依次點至靶板，利用MALDITOF MS進行檢測，根據抗生素峰是否缺失或峰強度降低及降解產物質譜峰是否出現，來判斷待測菌株是否具有相應的酶活性。表2中顯示，MALDI-TOF MS在1～4 h內可檢測革蘭陰性桿菌β內酰胺酶活性，除生物梅里埃公司的VITEK MS型質譜儀外，應用布魯克公司的Ultraflex、Microflex和Autoflex型質譜儀檢測β內酰胺酶活性的靈敏度和特異度達96%～100%，與傳統方法相比具有操作簡單直接，快速準確等優點，將來有可能成為臨床微生物實驗室的常規檢測方法［9］。應用MALDI-TOF MS檢測β內酰胺酶活性存在一定局限性：由于采用的基質和緩沖液不同，造成各實驗室所得抗生素及降解產物質譜峰分子量存在差異，這就需要設置各自實驗室的陽性和陰性對照，作為檢測結果的判斷依據［10］；僅能夠檢測耐藥株是否水解β內酰胺類抗生素，而不能判斷菌株對抗生素的耐藥程度［11］。

最近有研究報道，采用MALDI-TOF MS技術聯合SepsityperTMkit試劑盒或分離膠促凝管，不但可直接檢測陽性血培養中細菌，還可快速檢測陽性血培養中細菌的β內酰胺酶活性，對臨床調整抗生素治療方案、控制血流感染有重要意義［12-13］。

1.2 β內酰胺酶的檢測

β內酰胺酶是一類由細菌產生的酶蛋白質。將細菌蛋白質提取物用MALDI-TOF MS檢測，可直接鑒定細菌是否產生β內酰胺酶特異的質譜峰，MALDI-TOF MS的檢測結果可通過肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF） 分析得到驗證。PMF分析是目前蛋白質組研究中鑒定蛋白質較為常用的方法：首先提取細菌蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）或雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis， 2-DE）；再切取凝膠中β內酰胺酶蛋白條帶，經胰蛋白酶消化后產生肽段，采用串聯質譜（MALDI-TOF/TOF MS）或液相色譜質 譜（Liquid chromatography -mass spectrometry，LC-MS）鑒定出肽段序列；最后將肽段數據導入Mascot軟件，搜索匹配蛋白質種類。Mascot是目前使用最廣泛的蛋白質鑒定檢索軟件， 可以實現從質譜數據到蛋白質的鑒定。

表2 應用MALDI-TOF MS檢測革蘭陰性桿菌β內酰胺酶活性

CAMARA等［18］在含氨芐西林的LB肉湯中培養耐藥大腸埃希菌，通過甲酸和異丙醇裂解提取細菌蛋白質，將上清液點樣至靶板，干燥后再點樣基質芥子酸 （sinapic acid， SA），采用MALDI -TOF MS檢測發現在29 ku處存在特征質譜峰，通過PMF分析驗證該峰為β內酰胺酶。PAPAGIANNITSIS等［19］應用MALDI-TOF MS檢測產頭孢菌素酶弗氏枸櫞酸桿菌的提取物，發現在39 850 u處有特異性質譜峰，經PMF分析確證為CMY-2型頭孢菌素酶。LAU等［20］利用MALDI -TOF MS檢測產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌存在11 109 u特征質譜峰，經PMF分析鑒定為blaKPC型碳青霉烯酶，由于肺炎克雷伯菌pKpQIL質粒上的blaKPC基因與Tn4401轉位子相連，可將blaKPC基因通過質粒轉移接合至大腸埃希菌DH10B，采用MALDI -TOF MS和DNA序列分析均能證明發生轉移結合的大腸埃希菌存在11 109 u特征性質譜峰和Tn4401轉位子。

1.3 β內酰胺酶基因的SNP測序

PUSCH等［21］建 立 了 以MALDI-TOF MS為基礎的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）基因分型方法：首先通過PCR擴增出一段含有SNP的DNA（SNP位點前后各50 bp左右），用SNP酶去除掉PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物；再加入單堿基延伸引物，其3'末端堿基緊挨SNP位點，采用4種ddNTP替代dNTP；然后探針在SNP位點處僅延伸一個堿基，連接上的ddNTP與SNP位點的等位基因對應；最后應用MALDI-TOF MS檢測延伸產物與未延伸引物間的分子量差異，確定該位點處堿基，能夠推測DNA堿基序列的變化。

有相關研究報道［22-23］，基于MALDI-TOF MS 的SNP測序技術能清楚區分細菌質粒攜帶的β內酰胺酶基因上位點突變的質譜峰差異，從而準確檢測大腸埃希菌的SHV型和TEM型β內酰胺酶基因。基于MALDI-TOF MS的SNP測序是一種快速檢測β內酰胺酶基因的新方法，其檢測結果高度可靠、試劑成本低、適合于自動化操作且在一次實驗中可檢測多位點突變。

2 應用MALDI-TOF MS檢測膜孔蛋白

革蘭陰性細菌的外膜上存在多種外膜蛋白（outer membrane protein， Omp），其中膜孔蛋白（porin）對抗生素具有選擇通透性。若膜孔蛋白結構發生改變或者缺失，外膜通透性減弱，運輸至細菌壁膜間隙的β內酰胺類抗生素大量減少，使細菌對抗生素耐藥。

PMF是一種直接、有效的蛋白質組鑒定技術，近年來質譜技術已經應用于細菌外膜蛋白質組研究［24］。通常采用SDS-PAGE或2-DE電泳分離細菌外膜蛋白，切取凝膠中目的蛋白條帶，胰蛋白酶解蛋白質并純化肽段，再進行質譜儀檢測，最后在Mascot數據庫中檢索PMF代表的膜孔蛋白組分。應用質譜儀檢測不同革蘭陰性桿菌的膜孔蛋白的結果如表3所示［25-27］。最新一項研究建立了應用MALDI-TOF MS快速檢測大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌膜孔蛋白的方法，結果表明肺炎克雷伯菌質譜圖中38 ku和36 ku處峰缺失，與SDS-PAGE上42 ku的OmpK36 ku和40 ku的OmpA條帶缺失相對應；大腸埃希菌質譜圖中38 ku、37 ku和35 ku處峰缺失，與SDS-PAGE上41 ku的OmpC、40 ku的OmpF和38 ku的OmpA條帶缺失相對應［28］。該方法簡化了操作流程，且分辨率較高，可用于細菌膜孔蛋白缺失的快速篩查。

表3 應用MALDI-TOF MS檢測革蘭陰性桿菌膜孔蛋白和外排泵相關蛋白質

3 MALDI-TOF MS檢測外排泵系統

革蘭陰性桿菌的外排泵系統通過主動外排多種藥物，形成了低水平和非特異的耐藥性。革蘭陰性桿菌最主要的外排泵系統為耐藥結節分化超家族（resistance nodulation cell division family，RND），它是一組跨越細菌內膜和外膜的蛋白質，由內膜轉運蛋白、膜融合蛋白和外膜通道蛋白構成三聚體。應用質譜技術聯合蛋白質分離方法和生物信息學工具，不僅能檢測細菌外膜的膜孔蛋白，也能檢測細菌外排泵系統中的蛋白質組分。

XU等［25］對提取的大腸埃希菌總蛋白進行2-DE電泳，提純處理凝膠中蛋白質的肽段后，應用MALDI-TOF MS檢測并檢索，結果顯示為外排泵系統中外膜通道蛋白TolC和YhiU，通過蛋白質印跡法（Western blotting）驗證耐氨芐西林大腸埃希菌TolC和YhiU的表達量增加。在銅綠假單胞菌蛋白質組的研究中［26，30］，應用MALDI-TOF MS能成功檢測到外排泵系統中膜融合蛋白MexA和外膜通道蛋白OprM，經Western blotting證實MexA和OprM表達上調導致銅綠假單胞菌產生耐藥性。應用MALDI-TOF MS檢測不同革蘭陰性桿菌的外排泵相關蛋白質結果如表3所示［25-26，29-30］。

4 展望

MALDI-TOF MS具有自動化、高通量、操作簡便、樣本用量少和檢測準確度高等特點。它將微生物檢測時間由以小時計算推進到以分鐘計算，應用范圍從微生物的快速鑒定擴大到耐藥性檢測。隨著質譜技術的不斷發展、操作流程的簡化、微生物PMF和耐藥相關蛋白質組數據庫的豐富和擴展，我們相信臨床微生物實驗室未來也將具備檢測分析細菌蛋白質組的能力。基于微生物PMF和蛋白質組圖譜的MALDI-TOF MS技術是微生物領域的一場革命，這一技術未來可應用于細菌的分子流行病調查、細菌毒力因子和血藥濃度檢測，甚至可用來指導藥物分子靶點的篩選和新藥的設計，為患者提供個體化的治療方案，它將全面推進微生物快速診斷與耐藥性檢測的發展。

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Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry for detection of β-lactam resistance in gram-negative bacilli

LI Yuanrui， YU Jing， LIU Ying. （Department of Laboratory Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

R378.2

A

1009-7708（2016）02-0229-06

10.16718/j.1009-7708.2016.02.019

2015-06-18

2015-07-15

上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科臨床微生物室，上海 200092。

李媛睿（1990—），女，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制研究。

劉瑛，E-mail： lywjw0129@163.com。