萬古霉素聯合穿心蓮內酯對金黃色葡萄球菌生物膜的作用

祝司霞， 程 君， 杜小麗

·論著·

萬古霉素聯合穿心蓮內酯對金黃色葡萄球菌生物膜的作用

祝司霞， 程 君， 杜小麗

目的 觀察萬古霉素和穿心蓮內酯聯用對金黃色葡萄球菌（金葡菌）生物膜形成的影響。方法 體外構建金葡菌生物膜模型；XTT減低法評價萬古霉素和穿心蓮內酯聯用對金葡菌生物膜初始黏附能力的影響；鏡下觀察藥物對金葡菌生物膜的形態學影響。結果 1 000、500、250 mg/L的穿心蓮內酯和各個濃度（2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）的萬古霉素對金葡菌生物膜的早期黏附有抑制作用； 1 MIC萬古霉素和穿心蓮內酯聯合的抑制作用比單用萬古霉素強；250 mg/L的穿心蓮內酯和1 MIC萬古霉素聯用使細菌生物膜形態結構被顯著破壞。結論 一定濃度的穿心蓮內酯和萬古霉素對金葡菌生物膜的形成和黏附均有抑制作用，且二者恰當聯用可能具有協同作用。

萬古霉素； 穿心蓮內酯； 金黃色葡萄球菌； 生物膜

據美國國立衛生研究院（NIH）統計，超過80%細菌性疾病與細菌生物膜有關［1］。細菌生物膜是細菌附著在有生命或無生命物質表面后，由細菌及其所分泌的胞外多聚物（主要是胞外多糖）共同組成的膜狀細菌群體，是細菌為了適應周圍環境而形成的一種保護性生存方式。自然界中絕大部分細菌以生物膜的方式存在，細菌生物膜最顯著的特征是具有很強的黏附能力和抗藥性，其對抗菌藥物的耐藥性可以增加到浮游菌的1 000倍［2］，而且生物膜中的細菌可逃避宿主的免疫攻擊，致使其能在宿主體內長期存在，使感染遷延不愈。目前國內外抗生物膜治療主要側重于不斷研發新的抗菌藥物，但應用于臨床的抗生素和化學合成藥物具有一定的毒性作用，具生物膜細菌對這些常規藥物容易產生耐藥性，耐藥菌株有不斷增加的趨勢。有研究表明中藥和抗生素聯合應用有減量增效的優勢［3］。本研究通過在體外建立金黃色葡萄球菌（金葡菌）生物膜模型，觀察中藥穿心蓮內酯和萬古霉素對金葡菌生物膜的作用，從而為中藥和西藥聯合應用治療金葡菌感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 攀枝花學院附屬醫院和中心醫院檢驗科于2014年6—9月分離得到的40株金葡菌臨床菌株，用剛果紅平皿法篩選出生物膜陽性菌株。對照菌株為金葡菌ATCC25923，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養基 血瓊脂平皿（青島日水生物技術有限公司，產品編號：20140630）；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（青島日水生物技術有限公司，批號：20140228）；剛果紅平皿（剛果紅0.8 g/L，腦心浸液干粉37 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂20 g/L，氯化鈉40 g/L。用雙蒸水配制）。

1.1.3 藥物及試劑 鹽酸萬古霉素標準品（上海勵瑞生物科技有限公司，貨號：0990）；穿心蓮內酯標準品（中國食品藥品檢定研究院，110797-201108）；XTT（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：112073-21-1）；維生素K3（VK3，合肥博美生物科技有限責任公司）；剛果紅（合肥博美生物科技有限責任公司）；腦心浸出液肉湯（BHI）（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3102439）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.44 g，磷酸二氫鉀0.24 g，調pH 7.2，定容1 L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存）；林格液（氯化鈉9 g，氯化鉀0.12 g，氯化鈣0.24 g，蒸餾水1 000 mL ），所用試劑均為國產分析純。

1.1.4 儀器與材料 GH4500型隔水式培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DG5031型酶聯免疫檢測儀（華東電子集團醫療裝備有限責任公司）；YJ-875型醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備公司）；手提式高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司，20110936）；101-2AB型電熱鼓風干烤箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；96孔細胞培養板（合肥博美生物科技有限責任公司，產品編號：HC044）；蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選實驗菌株 參照文獻［4］，將從臨床獲得的40株金葡菌，接種在血平皿上，分離單個菌落，再將單個菌落接種于剛果紅平皿。37 ℃培養24 h后，再在溫室放置72 h。菌落變為黑色并出現結晶為生物膜陽性株，不產生生物膜的菌落仍然為紅色。

1.2.2 萬古霉素對金葡菌的MIC測定 參照文獻［3-4］ ，將實驗菌株接種于TSB中，于37 ℃培養8 h，菌液用TSB稀釋成D650nm值為0.1的菌懸液。培養基中加入藥物萬古霉素，用TSB連續稀釋，使培養液中的藥物濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。每管加入D650 nm值為0.1的菌懸液200 μL。空白對照管（只加TSB，不加細菌和藥物）、陰性對照管（只加TSB菌液，不加藥物），37 ℃培養24 h，觀察各個試管是否出現渾濁，并與空白和陰性對照比較，以未出現渾濁管的最低藥物濃度作為萬古霉素的MIC。

1.2.3 金葡菌生長量測定 根據周薇等［5］、王業梅等［6］的方法并略作改進，將實驗菌株接種于TSB中，于37 ℃增菌培養18 h，菌液用TSB稀釋成D650nm值為0.1的菌懸液，每孔取100 μL接種于96孔板中，37 ℃培養 0、2、6、8、24 h（每個時間設12個復孔），分別測定其D650nm值，棄去培養基與懸浮菌，蒸餾水清洗3次，56 ℃干燥1 h，1%結晶紫染色15 min，蒸餾水清洗3次，分別測定其D650 nm值。

1.2.4 穿心蓮內酯和萬古霉素對金葡菌黏附抑制試驗 參照文獻［7］，取D650 nm值為0.1的TSB菌液（接種環挑3～5個菌落，接種于4～5 mL的TSB中，35 ℃孵育4 h，增菌后的菌液用TSB校正濃度，使其D650 nm值為0.1，100 μL接種入96孔板中于37 ℃分別培養0、1、2、4 h，棄去懸浮菌，PBS清洗 3次，加入用TSB為稀釋液對倍稀釋配制的穿心蓮內酯（1 000、500、250、125、62.5 mg/L）和萬古霉素（2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）溶液各100 μL（每個濃度設8個復孔）；另設5組萬古霉素聯合穿心蓮內酯（125 mg/L穿心蓮加入2 MIC萬古霉素，250 mg/L穿心蓮加入2 MIC萬古霉素，125 mg/L穿心蓮加入1 MIC萬古霉素，250 mg/L穿心蓮加入1 MIC萬古霉素， 500 mg/L穿心蓮加入1 MIC萬古霉素）、空白對照孔（只加TSB，不加細菌和藥物）、陰性對照孔（只加TSB、菌液，不加藥物）各100 μL（每個濃度設8個復孔）。再于37 ℃培養24 h，加入XTT溶液（林格液稀釋為0.5 mg/L，0.22 μm孔徑的濾膜過濾除菌，臨用前加入VK3）100 μL ，37 ℃避光培養2 h，分別測定各孔D650 nm值。

1.2.5 觀察穿心蓮內酯和萬古霉素對金葡菌生物膜形態結構的影響 參照文獻［8］將滅菌的蓋玻片浸在D650 nm值為0.1的TSB菌液中，培養3 d（每天換1次菌液），使之形成生物膜模型，再分別加250 mg/L的穿心蓮內酯、1 MIC的萬古霉素、250 mg/L的穿心蓮內酯加入1 MIC的萬古霉素（每天換1次藥液），作用3 d，另設陰性對照（只加TSB菌液，不加藥物）。用鍍銀染色法（用滅菌生理鹽水多次充分漂洗經上述處理的蓋玻片，去掉浮游菌，在2.5%戊二醛PBS溶液中固定1 h，蒸餾水清洗1 min，飽和氯化鈣溶液結合15 min，蒸餾水清洗1 min，5%硝酸銀溶液反應15 min，1%對苯二酚溶液顯色2 min，蒸餾水清洗1 min，5%硫代硫酸鈉溶液固定2 min，蒸餾水清洗1 min。）顯微鏡（1 000 倍）觀察各模型形態的變化，根據其形態結構的變化判斷藥物的作用效果 。

1.2.6 統計學處理 實驗數據應用SPSS 19.0軟件處理，對相關數據進行統計分析。采用t檢驗組間比較，數據以± s表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金葡菌生長量測定

經過篩選，在40株臨床分離株中，有12株為生物膜陽性菌株，余為陰性，選擇1株生物膜強陽性菌株做實驗（結晶紫法測膜生長量），該菌株對萬古霉素的MIC值為2 mg/L。培養基中金葡菌的生長量隨著時間的增長呈上升趨勢，而黏附到96孔板上金葡菌的數量基本沒有太大變化。結果見圖1。

2.2 金葡菌黏附抑制試驗

與陰性對照孔相比，穿心蓮內酯在濃度125 mg/L和62.5 mg/L時作用0、1、2 h對金葡菌黏附均無抑制作用（P＞0.05），而其他濃度的穿心蓮內酯在0、1、2、4 h對金葡菌的黏附均有抑制作用（P ＜0.05）。與陰性對照孔相比，2、1、1/2、1/4和1/8 MIC的萬古霉素在0、1、2、4 h內對金葡菌黏附均有明顯抑制作用（P＜0.001）。但1/8 MIC萬古霉素對金葡菌黏附能力的影響幾乎和1 MIC效果一致，使用2 MIC時才出現更強的抑制效果；穿心蓮內酯和萬古霉素聯合用藥時，每個濃度組合都對金葡菌黏附有抑制作用（P＜0.001），但1 MIC萬古霉素和穿心蓮內酯聯合用藥抑制作用比單獨用藥加強，2 MIC萬古霉素和穿心蓮內酯聯合用藥的效果卻遠低于單用萬古霉素，見圖2，3，4。

圖1 金葡菌及其生物膜生長量曲線圖（n =12，± s）Figure 1 Growth curves of S. aureus and the corresponding biofilm formation（ n = 12， mean ± SD）

圖2 不同濃度的穿心蓮內酯對金葡菌黏附能力的影響（n =8，± s）Figure 2 Effect of andrographolide at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n=8， mean ± SD）

圖3 不同濃度的萬古霉素對金葡菌黏附能力的影響（n =8，± s）Figure 3 Effect of vancomycin at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n =8， mean ± SD）

2.3 藥物對金葡菌生物膜形態結構的影響

鏡下觀察，金葡菌在TSB培養3 d時形成密集的生物膜。與對照組相比，250 mg/L的穿心蓮內酯作用3 d后，密集的生物膜被破壞；1 MIC萬古霉素作用3 d后，對生物膜的形成有顯著抑制作用；250 mg/L的穿心蓮內酯和1 MIC萬古霉素聯用3 d后，生物膜的破壞更加明顯，見圖5。說明穿心蓮內酯和萬古霉素使金葡菌生物膜形態結構發生明顯變化，對金葡菌生物膜的形成有抑制作用。

圖4 不同濃度的穿心蓮內酯和萬古霉素聯用對金葡菌黏附能力的影響（n =8，± s）Figure 4 Effect of vancomycin in combination with andrographolide at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n=8， mean ± SD）

圖5 鍍銀染色觀察金葡菌在不同條件下的生長狀況（×1 000）Figure 5 Growth of S. aureus strain under different conditions， observed after silver staining （×1 000）

3 討論

與浮游細菌相比，有生物膜的細菌具有極強的耐藥性和抵抗機體免疫系統的作用，常引起許多慢性和難治性感染性疾病如慢性呼吸道、泌尿系統感染、感染性心內膜炎、齲齒、牙周炎等；另外，新型生物材料的應用日益增多，如人工關節、人工瓣膜等，一旦被細菌生物膜污染，它們被植入體內就會導致感染和移植的失敗，給人類健康帶來了嚴重的危害。因此細菌生物膜已成為全球關注的重大難題，如何防治細菌生物膜成為目前備受關注的研究領域。

金葡菌是以生物膜形式感染的常見病原菌之一。有報道，近年來內置物金葡菌感染生物膜形成發生率顯著增加，93.5%創傷慢性難愈合創面檢出金葡菌生物膜感染［9］。侵入機體的金葡菌可以黏附于宿主細胞形成生物膜，由于其中的絕大多數細菌處于靜止或休眠狀態，藥物不易滲入，導致感染菌難以清除，所以尋找有效的抗金葡菌生物膜的藥物迫在眉睫。

目前國內外對抗細菌生物膜的抗生素大多具有一定的毒性作用，且耐藥菌株不斷增加。而我國有豐富的中藥資源，某些中藥具有抗菌消炎的功效，且毒性作用小，較少出現耐藥性，但殺菌作用弱，起效慢。已有實驗證實，通過中西藥聯用可以發揮藥物減量增效的作用，可以更好地控制生物膜菌引起的相關感染［10］。

穿心蓮內酯是從中藥穿心蓮中提取出來的一種主要有效成分，具有清熱解毒、抗菌消炎、免疫調節、抗腫瘤等多種功效。臨床上被用于治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、肺炎、細菌性痢疾、腦膜炎、尿路感染、中耳炎、牙周炎、感冒發熱等疾病。研究表明，穿心蓮內酯對金葡菌無直接殺菌作用，但對其生物膜具有良好的抑制作用，且與其他抗生素聯用有協同殺菌作用［11-12］。萬古霉素具有強大的對抗金葡菌作用，所以本實驗采用穿心蓮內酯和萬古霉素聯合用藥的方式來對抗細菌生物膜。

結果顯示：在黏附方面，穿心蓮內酯除了125 mg/L和62.5 mg/L濃度外，其他濃度在0、1、2、4 h對金葡菌的黏附均有抑制作用，研究發現1 MIC萬古霉素和穿心蓮內酯聯合用藥抑制作用比單獨用萬古霉素加強，但2 MIC萬古霉素和穿心蓮內酯聯合用藥的效果卻遠沒有單用萬古霉素好，所以穿心蓮內酯和萬古霉素聯合用藥是否具有協同抑制黏附作用還有待于進一步研究；在形態結構方面，250 mg/L的穿心蓮內酯對生物膜有破壞作用，1 MIC萬古霉素對生物膜的形成有顯著抑制作用，250 mg/L的穿心蓮內酯和1 MIC萬古霉素聯用對生物膜的破壞更加明顯。

雖然本實驗初步證明了萬古霉素和穿心蓮內酯有抑制細菌生物膜的作用，但仍需要進一步研究論證，比如可以進行體內生物膜試驗，從基因和分子水平揭示藥物的作用機制等。此外，為制定出更有效的防治感染性疾病的策略，建議針對慢性難治性病例，要進行生物膜檢測，以確定是否有生物膜的相關感染，從而評估病情和確定最佳治療方案，但目前尚缺乏有效檢測手段；如何制定抗生物膜的有效標準也是亟待解決的醫學問題。

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Effects of vancomycin in combination with andrographolide on the biofilm formation of Staphylococcus aureus

ZHU Sixia， CHENG Jun， DU Xiaoli. （Department of Morphology， Medical College of Panzhihua University，Panzhihua Sichuan 617000， China）

Objective To observe the effects of vancomycin in combination with andrographolide on the biofilm formation of Staphylococcus aureus. Methods The in vitro model of Staphylococcus aureus biofilms was constructed. XTT reduction assay was used to evaluate the effects of vancomycin in combination with andrographolide on initial adhesion capability of Staphylococcus aureus biofilm. Microscope was used to observe the morphology of the biofilm after treatment. Results Andrographolide inhibited the early adhesion of Staphylococcus aureus at 1 000， 500 and 250 mg/L when combined with different concentrations of vancomycin （2 MIC， 1 MIC， 1/2 MIC， 1/4 MIC， and 1/8 MIC）. The concentration of 1 MIC vancomycin in combination with andrographolide inhibited adhesion significantly stronger than vancomycin alone. Andrographolide 250 mg/L plus 1 MIC vancomycin significantly destroyed the morphology and structure of the biofilms. Conclusions Andrographolide plus vancomycin at certain concentration can inhibit the biofilm formation and adhesion of Staphylococcus aureus. Their appropriate combination is likely to have a synergistic effect.

vancomycin； andrographolide； Staphylococcus aureus； biofilm

R378.11

A

1009-7708（2016）02-0189-05

10.16718/j.1009-7708.2016.02.011

2015-04-02

2015-09-14

攀枝花學院大學生創新創業訓練計劃項目（2014cxsy089）。

四川省攀枝花學院醫學院形態學教研室，四川攀枝花 617000。

祝司霞（1973—），女，碩士，講師，主要從事醫學微生物學教學與科研。

祝司霞，E-mail： pzhu001@126.com。