丹參提取液對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護作用*

楊 娥殷紅巖陳都紅陳德森（.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000）

·研究報告·

丹參提取液對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護作用*

楊 娥1殷紅巖1陳都紅1陳德森2△
（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察丹參提取液對缺血再灌注模型大鼠子宮的影響，為臨床研究子宮缺血再灌注損傷的防治提供理論依據。方法 SD大鼠36只，采用線栓法建立大鼠子宮缺血再灌注損傷模型，在術前連續(xù)7 d用丹參提取液灌胃進行干預并設為丹參組，另設假手術組和模型組作對照。檢測術后24 h大鼠子宮組織白介素-2 （IL-2）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）濃度，免疫組織化學法檢測子宮組織中Bcl-2和Bax蛋白表達。結果 與模型組比較，丹參組大鼠子宮組織中Bax蛋白表達、IL-2和MDA顯著降低（P＜0.05），而SOD活性、Bc1-2蛋白表達顯著提高（P＜0.05）。結論 丹參提取液對大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護作用，其作用機制可能與其下調Bax蛋白、提高SOD活性、抑制自由基對缺血再灌子宮組織的破壞、降低IL-2造成的炎癥反應有關。

丹參提取液 子宮缺血再灌注損傷 總超氧化物歧化酶 Bcl-2 Bax

【Abstract】Objective：To establish uterine ischemia reperfusion injury model of rat，and to observe the effect of Chinese herbal medicine Salvia miltiorrhiza extract on the uterus of rats with ischemia reperfusion injury to provide theoretical basis for clinical study of the prevention and treatment of uterine ischemia reperfusion injury.Methods：Uterine ischemia reperfusion injury model of 36 SD rats was established with thread embolism method，before operation receiving Salvia miltiorrhiza extract intragastric administration to intervene for 7 days as Danshen group.Sham operation group and the model group were used as control.The levels of IL-2，malondialdehyde （MDA），total superoxide dismutase（SOD）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected in 24 hours after operation，and the expression of Bc1-2 and Bax in uterine tissues was detected by immunohistochemistry.Results：Compared with the model group，Bax protein expression，IL-2 and MDA in the rat's uterine tissue of Salvia miltiorrhiza group decreased significantly（P＜0.05），and SOD activity and Bcl-2 protein expression increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：Salvia miltiorrhiza can Huoxue has the effects of blood circulation，regulating menstruation，removing blood stasis and anti-inflammatory and a protective effect on uterine ischemia/reperfusion injury in rats，whose mechanism may be related to reducing Bax protein，increasing the activity of SOD，inhibition of free radicals on ischemia reperfusion of uterine tissue damage and decreasing IL-2 caused by inflammation.

【Key words】Salvia miltiorrhiza extract；Uterine ischemia reperfusion injury；Total superoxide dismutase；Bcl-2

任何子宮手術和有創(chuàng)檢查均有可能發(fā)生子宮缺血再灌注損傷并影響子宮的生殖功能［1］。臨床以胎盤早期剝離、子宮破裂、剖宮產、流產引產等手術造成的缺血再灌注損傷為重，近年來研究表明丙二醛（MDA）與組織器官缺血再灌注損傷有關［2］。而臨床常用的子宮收縮藥如縮宮素催產和引產及產后出血均有可能造成子宮收縮止血或阻斷血管止血的同時造成子宮缺血再灌注損傷［3］，故如何減輕或防治子宮缺血再灌注損傷是本研究的目的。活血調經和祛瘀消炎是丹參主要藥性，藥理研究表明其可抗自由基、抗氧化、擴張血管、增加缺血組織血液流量，抑制缺血區(qū)組織細胞內鈣超載而發(fā)揮對缺血再灌注損傷的組織修復作用［4］。本實驗通過測定大鼠子宮組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）濃度、Bcl-2和Bax蛋白表達等指標來探討中藥丹參提取液對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護機制，為臨床研究子宮缺血再灌注損傷的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級SD雌性大鼠36只，體質量179～245 g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供［許可證號：SYXK（鄂）2011-0031］，手術操作均在標準手術室進行 ［SCXK（鄂）2011-0008］。術后動物房溫度保持在20～22℃，濕度50%～75%，24 h交替光照，分籠飼養(yǎng)動物，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)即可。

1.2 藥物及試劑 丹參 （十堰市太和醫(yī)院中藥房提供）；水合氯醛（北京化學試劑公司提供）；Bcl-2和Bax蛋白測試盒 （北京博凌科為生物科技有限公司提供）；SOD、MDA、乳酸脫氫酶（LDH）和白介素-2（IL-2）試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）。

1.3 干預方法 先將實驗動物編號，用隨機數字表隨機分為假手術組、模型組和丹參組。參照人與動物體表面積換算公式［5］，丹參組在術前連續(xù)7 d用10 mg/d劑量丹參提取液灌胃給藥進行干預，模型組和假手術組給予腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 模型制備 參照吉小微等［6］線栓法制備子宮缺血再灌注模型。造模前禁食不禁水，用體積分數為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），起效后腹部向上固定于大鼠手術固定器，碘伏消毒，于恥骨聯合上2 cm處向上腹正中切開腹腔暴露子宮。然后從尾靜脈注射50 U/kg肝素，5 min后翻出兩側腹壁組織，在子宮底處用5號絲線縫分別結扎兩側子宮，用玻璃分針鈍性分離大鼠腹主動脈并用4號絲線結扎之，30 min后去除兩側子宮和腹主動脈結扎線復灌。模型組手術同上，假手術組僅開腹不結扎，5 min后關閉腹腔。

1.5 標本采集與檢測 參照文獻 ［7］擬定，于干預前和造模后4 h，3組各取6只大鼠，處死，分別取其子宮組織，-30℃低溫冰箱暫存待測。1）IL-2、MDA、SOD和LDH濃度檢測。分別取子宮組織研磨，勻漿，5000 r/min離心10 min，取上清液，嚴格按試劑盒步驟操作，用分光光度計檢測子宮組織中IL-2、MDA、SOD和LDH濃度。2）Bcl-2和Bax蛋白陽性表達檢測。采用免疫組織化學法，參照文獻［8］提取Bcl-2和Bax蛋白，取暫存子宮標本，多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、脫水、切片（厚約5 μm）。烤片，脫水后抗原修復，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min；滴加辣根過氧化物酶標記工作液，反應染色后沖洗，蘇木精復染，脫水后封固。Bcl-2和Bax陽性為胞質及胞膜內側出現黃至棕黃色顆粒，取5個高倍鏡視野（400倍）計數每個高倍鏡視野內的陽性細胞數和細胞總數，取平均值。1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，用LSD檢驗顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 丹參提取液對大鼠子宮組織中IL-2和LDH的影響 見表1。模型組干預后子宮組織IL-2和LDH含量均明顯升高，與本組干預前和假手術組干預后同時期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。丹參組干預后IL-2含量降低，但仍高于假手術組，與模型組干預后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組子宮組織中IL-2和LDH水平比較（±s）

表1 各組子宮組織中IL-2和LDH水平比較（±s）

與本組干預前比較，*P＜0.05；與假手術組干預后比較，△P＜0.05；與模型組干預后比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 時間 LDH（μmol/L） IL-2（ng/mL）假手術組 干預前 150.81±19.33 0.89±0.15 （n=6） 干預后 153.81±21.34 0.94±0.18模型組 干預前 147.06±22.74 0.91±0.27 （n=6） 干預后 185.71±23.42*△2.87±0.42*△丹參組 干預前 143.71±18.83 0.85±0.25 （n=6） 干預后 179.29±17.39*1.26±0.38▲

2.2 丹參提取液對大鼠子宮組織MDA和SOD的影響 見表2。模型組干預后大鼠子宮組織MDA明顯升高，SOD明顯降低，與干預前和假手術組干預后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組干預后比較，丹參組MDA顯著降低，SOD明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組子宮組織MDA和SOD水平比較（μmol/L，±s）

表2 各組子宮組織MDA和SOD水平比較（μmol/L，±s）

組別 時間 MDA SOD假手術組 干預前 1.81±0.22 127.82±13.78 （n=6） 干預后 1.72±0.16 120.71±15.27模型組 干預前 1.57±0.24 119.63±17.12 （n=6） 干預后 65.31±7.92*△62.08±6.07*△丹參組 干預前 1.78±0.16 123.79±15.29 （n=6） 干預后 5.95±0.37▲102.05±15.71▲

2.3 丹參提取液對大鼠子宮組織Bcl-2和Bax蛋白陽性表達的影響 見表3。模型組干預后Bax蛋白陽性表達顯著增強，Bcl-2降低，與干預前和假手術組干預后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組干預后比較，丹參組Bcl-2表達明顯增強，Bax蛋白陽性表達有一定程度下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

丹參性涼、味苦、歸心、肝經，具有活血調經、消癥化瘀、排膿消腫之功效，用于婦女癥塊、血瘀經閉、惡露、月經不調等頑疾［9］。《本草綱目》謂丹參 “補新血，調經脈，心經邪火，令血調和，此其滋養(yǎng)而生血也”［10］。現代藥理研究發(fā)現，丹參提取液中富含水溶性丹參素和脂溶性丹參酮ⅡA等［11］。亦有研究表明，鈣超載是引起缺血再灌注損傷的根源，缺血再灌注時自由基大量生成，脂質過氧化促使膜的通透性增高，溶酶體膜損傷引起溶酶體釋放，破壞細胞結構和功能造成線粒體功能障礙，故極時阻止脂質。

表3 各組子宮組織Bcl-2和Bax蛋白表達比較（±s）

表3 各組子宮組織Bcl-2和Bax蛋白表達比較（±s）

組 別 時 間 Bcl-2蛋白吸光度值 Bax蛋白吸光度值假手術組 干預前 5.10±0.27 4.61±0.27 （n=6） 干預后 4.93±0.18 4.27±0.16模型組 干預前 4.99±0.29 4.95±0.26 （n=6） 干預后 2.97±0.47*△29.01±5.12*△丹參組 干預前 4.84±0.54 5.12±0.21 （n=6） 干預后 12.71±2.33▲11.74±1.19▲

觀察發(fā)現，模型組缺血再灌注后子宮組織IL-2、MDA和LDH含量、Bax蛋白陽性表達顯著增強，Bcl-2蛋白和SOD明顯降低，提示缺血再灌注造成機體各種指標改變，造模方法可靠。丹參組干預后較模型組干預后大鼠子宮組織IL-2、MDA和LDH含量、Bax蛋白陽性表達下調，Bcl-2和SOD明顯增高，提示丹參提取液具有明確的缺血再灌注保護作用。在本實驗中，子宮組織復灌后，產生自由基會加劇脂質過氧化反應，生成有細胞毒性的產物MDA，加速生物膜的破壞。有研究發(fā)現，水溶性丹參素是超氧陰離子清除劑，與SOD的作用相似，可清除超氧陰離子，減少氧自由基的產生［12］。另外，脂溶性丹參酮ⅡA可通過阻斷羥自由基的合成并最終清除線粒體的脂質自由基［13］。姚常柏等［14］研究發(fā)現丹參注射液對H-Fe體系中的羥自由基的清除率達65%，對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中的超氧陰離子的清除率達100%。IL-2作為炎癥介質，在機體發(fā)生炎癥反應時，主要起到誘導和激活T、B淋巴細胞的作用，IL-2增多時可增強中性粒細胞的溶酶體酶活性，增強由T、B淋巴細胞介導的細胞吞噬功能［15］，故IL-2增多會造成過度炎癥反應而加重組織細胞損傷。本實驗中，丹參組大鼠在干預后IL-2明顯降低，提示丹參提取液通過抑制T、B淋巴細胞分化，阻斷IL-2介導激活T、B淋巴細胞介導的細胞吞噬功能，減少炎癥細胞對缺血缺氧子宮浸潤，達到避免或減少炎癥反應加重的現象［16］。缺血再灌注后子宮組織存在細胞凋亡現象，Bcl-2和Bax蛋白與凋亡調控直接相關，Bc1-2蛋白水平增高可抑制細胞凋亡，Bax蛋白水平增高會促進細胞凋亡。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白，在抗凋亡中發(fā)揮重要作用，可阻斷因氧自由基、缺血缺氧等刺激引起的細胞凋亡［17］。丹參組Bax表達降低、Bcl-2表達增高，這可能是丹參提取液中的脂溶性丹參酮ⅡA對子宮缺血再灌注損傷時，可能通過阻斷羥自由基的合成并最終清除線粒體的脂質自由基［18］，抑制細胞凋亡Bax蛋白，增高Bcl-2而抑制細胞凋亡，起到缺血再灌注損傷的保護作用。

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Protective Effect of Salvia Miltiorrhiza Extract on Rat with Uterine Ischemia Reperfusion Injury

YANG E，YIN Hongyan，CHEN Douhong，et al.Taihe Hospital of Shiyan，Hubei，Shiyan 442000，China.

R969 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1515-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.017

湖北省十堰市科技局資助課題（ZD2013003）

（電子郵箱：glhcds@163.com）

2016-03-30）