熱刺激對大鼠下丘腦神經損傷相關因子作用研究*

康欣欣唐志鵬王立娟劉琳琳吳中華（1.上海中醫藥大學中醫文獻研究所，上海 010；.上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病研究所，上海 000；.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院北院，上海 01999；.上海中醫藥大學科技實驗中心，上海 010）

2.1 一般情況觀察 實驗前，兩組動物活動、飲食正常；實驗過程中，相較正常組，熱刺激組大鼠興奮度增高，對外界刺激易激動，反應激烈，進食量及飲水增加，大小便同時增多。兩組每日平均體質量走勢如圖1所示，熱刺激組與正常組相比，體質量較輕，且差距逐漸加大（P＜0.05），但體質量增速無明顯差異。

·實驗報告·

熱刺激對大鼠下丘腦神經損傷相關因子作用研究*

康欣欣1，2唐志鵬2△王立娟2劉琳琳3吳中華4
（1.上海中醫藥大學中醫文獻研究所，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病研究所，上海 200032；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院北院，上海 201999；4.上海中醫藥大學科技實驗中心，上海 201203）

目的 觀察熱刺激后，下丘腦瞬時電位感受器陽離子通道V1子類（TRPV1）、α-CGRP、β-CGRP、生長阻滯和DNA損傷基因（Gadd45a）及生長相關蛋白43（Gap43）的mRNA含量，探討外周熱刺激狀況下，神經中樞的應答狀況。方法 20只Wistar大鼠隨機分為正常組與熱刺激組，熱刺激組用熱的辣椒乙醇溶液灌胃及熱烘飼養法飼養2周，觀察大鼠活動、飲食及大小便狀況，體視顯微鏡及HE染色法觀察大鼠胃黏膜病理改變。同時用RT-PCR法檢測兩組下丘腦的TRPV1、α-CGRP、β-CGRP、Gadd45a及GAP43的mRNA表達情況。結果 熱刺激組大鼠興奮度增高，飲食及大小便都增加，但體質量增長減緩，體視顯微鏡及病理切片觀察顯示胃黏膜充血水腫，5種mRNA含量均明顯升高（P＜0.05）。結論 外周熱刺激不但引發末梢感受器的組織損傷，也引發了下丘腦的神經細胞損傷，同時中樞產生活躍的組織修復活動，并增加神經遞質的分泌，加強對溫度調控信號的傳遞。

熱刺激 TRPV1 CGRP Gadd45a GAP43

【Abstract】Objective：To observe the concentration of TRPV1，α-CGRP，β-CGRP，Gadd45a and GAP43 in hypothalamus after thermal stimulation，and to investigate the response of nerve centers to peripheral hot stimulus.Methods：20 Wistar rats were randomly divided into 2 groups：the normal group and the thermal damage group.The thermal damage group was fed in warm condition for two weeks by stomach tube with a hot mixed solution made by ethanol and peppers.After that，the conditions of movement，eating and drinking，urine and stool of the rats were observed.Then the Wistars's gastric mucosal lesions were also studied with stereo microscope and HE staining method.At the same time，the mRNA expression condition of TRPV1，α-CGRP，β-CGRP，Gadd45a and GAP43 in hypothalamus were measured with the Real time-PCR method.Results：The rats′excitement level，diet amount，urine and stool were all enhanced.However，their weight increasing rate was reduced.Stereo microscope observation and Pathological examination all showed a mucosal hyperemia and edema.The concentrations of 5 mRNAs all significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：The peripheral thermal stimulus damage not only the outer issues，but also the nerve cells in the hypothalamus.At the same time，the nerve centers result in an active issue recovery，and increase the output of neurotransmitter to enhance the transmission of thermoregulation.

【Key words】Thermal stimulus；TRPV1；CGRP；Gadd45a；GAP43

維持體溫的相對恒定是機體一切生理活動的基礎。經典的體溫調節模式是：致熱源或者致冷源刺激溫度感受器，傳入神經將刺激信息傳入體溫調節中樞，中樞發出降溫或升溫的調控指令，該指令經過傳出神經進入外周效應器，引起內分泌腺、骨骼肌、皮膚血管和汗腺等組織、器官活動的改變，從而調整產熱和散熱的過程，諸如：毛孔擴張或收縮、汗液分泌增加、肌肉收緊、血流加速或減緩等反應［1］。引起溫度升高的熱刺激中有外周環境溫度、濕度，飲入熱性食物、化學藥物、炎癥感染等多種因素。人們通過截斷下丘腦以上腦組織及下丘腦以下腦組織的方法，確定下丘腦為體溫調節的中樞。傳統認為，溫度的刺激能引發外周的組織損傷，而中樞對于溫度刺激的應答機制尚不清楚。辣椒被認為是一種熱性食物，引發人體的熱性改變，因此可以作為一種內源性熱刺激源［2］。由于熱刺激引起的中樞應答機制缺乏實驗數據支持，基于此，本實驗嘗試對大鼠進行熱的辣椒乙醇溶液刺激，以此模擬內源性的熱刺激，同時將大鼠至于熱烘環境中，模擬外源性的熱刺激，病理觀察胃黏膜損傷，并用realtime-PCR方法檢測大鼠下丘腦的瞬時電位感受器陽離子通道V1子類（TRPV1）、α-CGRP、β-CGRP、生長阻滯和DNA損傷基因（Gadd45a）與生長相關蛋白43（Gap43）的mRNA表達，研究大鼠下丘腦對熱刺激之后的應答機制，以探討體溫中樞在熱刺激之后的反應機理。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

選用清潔級雄性健康wistar大鼠20只，體質量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。大鼠為同一批繁殖并在實驗觀察期間嚴格控制在同一飼養環境和條件下。在上海中醫藥大學實驗動物中心（SXYK滬2009-0069）清潔級動物房適應性喂養3 d后開始實驗，實驗期間大鼠自由攝食飲水，飼養室光照12 h，黑暗12 h，室溫22～24℃，濕度45%～65%。

1.2 儀器

Adventurer Ohaus AR1140/C型電子分析天平（美國奧豪斯公司）；Sonics超聲細胞破碎儀（美國SONICS ＆MATERIALS公司）；臺式高速冷凍離心機Centrifuge 5417R（德國EPPENDORF公司）；實時熒光定量PCR 儀7500 fast（美國ABI）；紫外分光光度計752（上海第三分析儀器廠）高壓蒸汽消毒器YXQ.SGH.280（上海醫用核子儀器廠）；低溫冰箱MDF-292（SANYO CO.）體視顯微鏡；DV4 quotation。

1.3 試劑

DEPC，DEPC處理水（天根生化科技公司）；異丙醇，氯仿，75%預冷乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）及70%、10%乙醇（自配）；Trizol液，反轉錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（takara）。0.5 mL DEPC加于500 mL雙蒸水中，室溫下搖床過夜，加熱消毒后密封保存。

1.4 實驗藥物

干辣椒（茄科植物，辣椒屬，簇生椒，Capsicum annuumvar.fasciculatum），購自上海禾煜貿易有限公司。將干辣椒50℃烘干，烘干至衡重，即稱重。粉碎成細末，過80目篩。將粉碎后的辣椒干以70%酒精水浴70℃浸泡3次，每次時間為1 h，料液比為1∶12。將萃取液減壓水浴蒸餾，蒸餾溫度為60℃，得油狀物。將蒸餾后的提取物以10%乙醇溶解，并定容至料液比為0.3 g/mL。將辣椒油密封置于4℃冷藏備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 分組與處理 將20只Wistar大鼠隨機數字表達法分成兩組，正常組、熱刺激組各10只，適應性喂養3 d后，開始灌胃。灌胃劑量為0.02 mL/g。正常組予0.9%氯化鈉注射液，飼養環境溫度為室溫22～24℃，濕度45%～65%。熱刺激組予10%乙醇的辣椒溶液（60℃），每日1次，保持飼養環境溫度30℃，濕度45%～65%。造模灌胃熱烘共7 d，再恢復正常飼養7 d，制成熱刺激模型。觀察大鼠行為、體質量、飲水進食、大小便量、性狀。自賁門處至幽門處切除大鼠胃，并沿胃大彎剪開，以0.9%氯化鈉注射液沖洗內容物后，以10%甲醛固定，以蘇木精-伊紅（HE）染色法制備病理切片。術前禁食不禁水24 h，以CO2窒息法處死大鼠，摘取大鼠下丘腦，置-70℃保存。

1.5.2 mRNA抽提 取組織50 mg，加入1 mL Trizol液，充分勻漿；22℃，靜置5 min；加入氯仿0.2 mL，顛倒混勻15 s；22℃，靜置3 min；4℃，14000 r/min離心15 min。取上清液0.5 mL；加入0.5 mL異丙醇，混勻；22℃，靜置10 min；4℃，14000 r/min離心10 min。棄上液，加入1 mL 4℃75%乙醇，充分混勻；4℃，10000 r/min離心5 min。棄上液，真空干燥5 min；用40 μL DEPC處理水溶解，-80℃保存備用。

1.5.3 RT-PCR 1）分光光度計檢測RNA的濃度。取樣本5μL加入石英比色杯內，加入雙蒸水1 mL，充分混勻。與雙蒸水對照。讀260 nm和280 nm測得值，當260 nm與280 nm的比值在1.8與2.0之間時，表示樣本RNA純度較高，并記錄。計算：OD260為1時，為40 μg RNA。所以計算如下：樣品總RNA含量 （μg/μL）= OD260×稀釋倍數×40/1000；樣本RNA含量 （μg/μL）= OD260×200×40/1000=OD260×8。2）反轉錄合成DNA。在20 μL反應體系中分別加入組織總RNA 2 μg、5XRT master mix 4 μL加水至20 μL。混勻，離心，孵育37℃15 min，85℃5 s，-20℃保存。3）PCR擴增。所用引物序列為：TRPV1 Forward 5′-AGTAACTGCCAGGA GCT GGA-3′，Reverse 5′-GTGTCATTCTGCCATTGTG-3′；α-CGRP Forward 5′-GCTGCATTGGTGCAGAACTA-3′，Reverse 5′-GTGGGCACAAAGTTGTCCTT-3′；β-CGRP Forward 5′-CCCAGAAGAGATCCTGCAAC-3′，Reverse 5′-GTGGGCACAAAGTTGTCCTT-3′；Gadd 45a Forward 5′-TAACTGTCGGCGTGTACGAG-3′，Reverse 5′-GCAACAGAAAGCACGAATGA-3′；Gap43 Forward 5′-GGCTCTGCTACTACCGATGC-3′，Reverse 5′-GACGGCGAGTTATCAGTGGT-3′。在20 μL反應體系中分別加入反轉錄產物2 μL、Sybrgreen 10 μL、上游引物（5 μmol/L）1 μL、下游引物（5 μmol/L）1 μL、RoxDye（Ⅱ）0.4 μL，加水至20 μL。PCR擴增條件為：（1）95℃30 s；（2）95℃3 s，60℃30 s，40個循環；（3）擴增產物分析：數據采用儀器自帶軟件ABI 7500 fast Software v2.0分析。TRPV1、α-CGRP、β-CGRP、Gadd45a 與GAP43表達水平以它們與actin的相對表達量來計算。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，兩組間比較，若符合方差齊性和正態分布，采用獨立樣本t檢驗；若不符合方差齊性和正態分布，則采用非參數檢驗的Wilcoxon檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 實驗前，兩組動物活動、飲食正常；實驗過程中，相較正常組，熱刺激組大鼠興奮度增高，對外界刺激易激動，反應激烈，進食量及飲水增加，大小便同時增多。兩組每日平均體質量走勢如圖1所示，熱刺激組與正常組相比，體質量較輕，且差距逐漸加大
（P＜0.05），但體質量增速無明顯差異。

圖1 兩組體質量變化趨勢

2.2 兩組胃病理組織體視顯微鏡觀察 見圖2。正常組大鼠胃體色淡紅，隱約可見少量脈絡，質軟有彈性。熱刺激組大鼠胃體色鮮紅，有明顯暗紅色瘀斑，黏膜下血管清晰可見，質略硬而有緊實感。

圖2 兩組胃體病理組織（HE染色，12倍）

2.3 兩組胃病理切片 見圖3。正常組大鼠胃黏膜絨毛柱狀上皮細胞排列整齊，腺體形態規則，肌層紋理清晰，黏膜下血管無血細胞充盈。熱刺激組大鼠胃黏膜上皮細胞排列尚整齊，部分核體增大，染色加深，肌層變薄，黏膜下血管充盈，淤積大量紅細胞，并出現黏膜下水腫。

圖3 兩組胃黏膜病理組織（HE染色，100倍）

2.4 兩組mRNA表達比較 見表1。5種mRNA的表達，熱刺激組均高于正常組，其中TRPV1、Gadd45a與Gap43有極明顯差異 （P＜0.01），α-CGRP與β-CGRP有較明顯差異（P＜0.05）。

表1 各組小鼠5種mRNA表達的比較（±s）

表1 各組小鼠5種mRNA表達的比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n β-CGRP Gadd45a Gap43正常組 10 0.824±0.058 0.730±0.053 1.059±0.033熱刺激組 10 0.978±0.121*0.952±0.127**1.482±0.061**TRPV1 α-CGRP 0.976±0.131 0.757±0.085 1.536±0.279**0.927±0.145*

3 討 論

熱邪是中醫學外邪致病理論中十分重要的一個致病因素，同時熱證也是重要的證型之一，而關于熱邪與熱證的本質目前尚處于探討階段。熱刺激對于機體產生的影響以往多集中于與刺激源接觸的刺激末端，而對于中樞的熱回饋研究較少。本實驗從溫度感受器、神經信號傳導因子、神經損傷修復因素的角度探討熱刺激對神經中樞的影響機制。

TRPV1是一個典型的溫度敏感型通道，當溫度＞43℃時即被激活［3］。通道開放，引起細胞外Ca2+內流和胞內Ca2+庫的釋放，升高胞內Ca2+濃度，進而激活一系列細胞內信號，形成動作電位，使中樞產生燒灼樣疼痛等不適感［4］。本實驗中，60℃辣椒乙醇溶液的內刺激及30℃飼養環境的外刺激，使得大鼠接收熱刺激的感應器將信號傳遞至中樞，引發中樞的“熱感受”，其表現即為下丘腦的TRPV1含量升高。

降鈣素基因相關肽（CGRP）神經信號傳遞中重要的一種生物多肽，廣泛分布于腦內及與體表感覺有關的脊髓背角和初級傳入纖維，特別是感覺神經元的胞體和末梢內［5］，通常分為2類：α-CGRP和β-CGRP或者CGRP1和CGRP2。它參與多種生理活動，如嗅覺、聽覺、學習、攝食、自主神經功能、運動活動、傷害性感覺的形成與維持及血管擴張等。當加載損害性刺激時，如：炎癥介質、缺氧、甲狀腺素等皆可促進CGRP從神經末梢的釋放，營養神經的神經生長因子（NGF）［6］和膠質源性神經營養因子（GDNF）［7］也可以提高神經的CGRP表達，這種現象常見于神經的損傷修復反應中，表明CGRP表達增加是神經細胞活性提高的表現。本實驗證實了由外周的熱刺激，以及內在的辣椒乙醇溶液促進了作為溫度調節中樞的下丘腦的CGRP的釋放，提示CGRP是傳導外來熱刺激及傷害性刺激的神經遞質，同時也是機體對這類刺激的產生應答的結果，即機體通過增加CGRP的分泌來傳遞信號，調控外周效應器對刺激產生應答。

Gadd45a，又名DNA損傷誘導基因（DDIT1），它在調控細胞凋亡中具有重要作用，能通過G1-S期的控制參與維持基因組的穩定性［8］，也能誘導細胞G2-M期的阻滯。Gadd45a在多種損傷因素如：電離輻射、紫外線照射、烷化劑、二甲基苯蒽、血清饑餓、各種化療藥物等的作用下表達迅速上調［9］。因此，Gadd45a表達增加是細胞損傷和修復的信號。本實驗經過熱刺激之后，Gadd45a明顯升高，表明外周的細胞損傷已經出現，并進而影響到中樞神經產生修復性的應答。

Gap43是一種分子量為43 kDa的膜相關蛋白，主要分布于軸突生長錐以及突觸前膜。它是一種軸突出芽和突觸再生的標志性蛋白［10］，又是一種能與鈣調蛋白（CaM）結合的磷酸化蛋白，具有調節鈣緩沖和鈣調蛋白效力的功能［11］。一般在神經元內Ca2+濃度較低，GAP-43與CaM緊密結合，并將CaM隔離于膜區域［12］，當神經元受到外界刺激時引起Ca2+內流。雖然Ca2+內流可以促進神經元的興奮和遞質的釋放，但Ca2+過度內流可誘導GAP-43與CaM解離，隨即GAP-43磷酸化［13］。活化的GAP-43與細胞骨架成分相互作用，為神經元軸突的修復和再生提供了營養支持，軸突內的GAP-43含量增加，待建立起完整的突觸聯系后，GAP-43去磷酸化并與CaM重新結合，GAP-43水平才急劇下降，從而形成一個反饋環［14］，因此在發育成熟的中樞神經系統中，GAP-43的表達可作為評估軸突損傷和再生反應的一個可靠指標［15］。本實驗中GAP43含量明顯升高，表明熱刺激已經引發神經中樞的損傷，且這種修復活動正進入活躍狀態。

本實驗熱刺激動物模型給予內外雙重熱刺激，符合中醫學嗜食辛辣或感受溫熱外邪的熱證成因。熱刺激1周，再消除外界刺激，恢復正常喂養，以檢測前期熱刺激對大鼠體質形成較穩定的影響。該模型依據病因造模，符合熱因素致病的機理。實驗中，大鼠予熱刺激之后，情緒活躍，代謝加速，出現易激好動，飲食增加，大小便增加的現象，同時體視顯微鏡觀察和病理切片顯示大鼠胃受到物理和化學的熱刺激，黏膜下血管明顯充血水腫。因此證明，通過60℃辣椒乙醇溶液的熱刺激，大鼠體溫調控系統的外周感應器環節出現了組織損傷。

本實驗結果支持以下結論，內外熱刺激損傷觸及外周末梢組織，而且通過分布于外周的溫度感應器將熱信號傳遞到神經中樞，引發中樞神經細胞的TRP通道打開，胞外Ca2+內流，胞內Ca2+在CGRP作用下進入胞質內，引發胞內Ca2+濃度升高，造成神經中樞的損傷，并進而引發GAP43與CaM解離，GAP43磷酸化之后，與細胞骨架成分相互作用，為神經元細胞的修復再生提供營養支持，引發相應的損傷修復行為。同時CGRP進入神經元細胞的突出末端，將神經中樞對熱刺激的應答信號傳遞到外周效應器，引發相應的溫度調控和適應過程。

因此，可以初步認為，過量的熱刺激不但引發末梢組織細胞的損傷，同樣也會通過體溫調控軸，造成下丘腦神經中樞的損傷修復反應。至于不同量熱刺激引發的機體反應以及下丘腦的具體反應部位及機制則需要進一步實驗證明。同時，以上指標也可以為熱本質研究提供參考。

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Study on the Effect of Thermal Stimulation on the Related Factors of Hypothalamic Nerve Injury in Rats

KANG Xinxin，TANG Zhipeng，WANG Lijuan，et al.Institute of Traditional Chinese Medicine Literature，Gastroenterology department in Longhua Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China.

·實驗報告·

R338.2+7 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1543-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.027

上海中醫藥大學橫向課題“溫胃方、清胃方防治胃寒證和胃熱證的實驗研究”支持（編號：778）

（電子郵箱：zhipengtang@sohu.com）

2016-03-14）