苦參堿對人角膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響

鄧 珍袁滿紅周珍華劉洪偉（.浙江省杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 00；.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽 400；.天津市第四中心醫(yī)院，天津 0040；4.重慶市中醫(yī)院，重慶 4000）

·實驗報告·

苦參堿對人角膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響

鄧 珍1袁滿紅2周珍華3劉洪偉4△
（1.浙江省杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 311100；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽 421001；3.天津市第四中心醫(yī)院，天津 300140；4.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的 觀察苦參堿對體外培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法 將分離培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞（HCFs）純化后，用不同濃度的Mat干預(yù)培養(yǎng)的HCFs的生長，并以0.1%地塞米松作為對照，在干預(yù)48 h后用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。結(jié)果 Mat在80 mg/L以下的藥物濃度處理HCFs 48 h后，未引起其明顯的凋亡率的改變，并能使其細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。而160 mg/L以上的藥物濃度處理HCFs 48 h后，引起明顯的細(xì)胞凋亡。結(jié)論 Mat在80 mg/L以下的濃度范圍內(nèi)，既能阻滯HCFs的細(xì)胞周期，又不增加其凋亡的發(fā)生率。

苦參堿 角膜成纖維細(xì)胞 細(xì)胞周期 凋亡

苦參堿（Matrine）是從豆科槐屬植物苦豆子、苦參等中分離得到的生物堿，屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物，具有多方面的藥理活性和臨床功能［1-6］。苦參型生物堿的主要活性成分為C15H24N2O［7-8］，其功效豐富，但最重要的是其抗成纖維細(xì)胞增殖作用。激光角膜屈光性手術(shù)治療屈光不正，已經(jīng)讓接受治療的近視患者獲得了較為滿意的裸眼視力，但是仍有患者會因為haze的出現(xiàn)而影響視力。研究表明，基質(zhì)成纖維細(xì)胞的過度增殖是引發(fā)角膜屈光性手術(shù)后haze和屈光回退的原因［9］。

因此，有效地抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物無疑將會改善激光角膜屈光手術(shù)的預(yù)后，讓患者獲得更大的滿意度。目前應(yīng)用于激光角膜屈光手術(shù)后抗增殖的藥物最常見的是糖皮質(zhì)激素，但是由于此激素對于眼睛的不良反應(yīng)，限制了其廣泛應(yīng)用。隨著對苦參堿研究的深入，我們有望尋找到一種能替代糖皮質(zhì)激素的抗成纖維細(xì)胞增殖安全有效的藥物?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本與試藥 南華大學(xué)附二醫(yī)院眼科角膜移植術(shù)后剩下的角膜環(huán)被用于本課題的研究 （來源是否符合醫(yī)學(xué)倫理委會員審查）。苦參堿（Mat）的標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所。地塞米松（Dxm）的標(biāo)準(zhǔn)品，胰蛋白酶：美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基：杭州四季青生物工程公司。鼠抗人AE1/AE3單克隆抗體、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Ⅱ型膠原酶：武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Galaxy）來自美國RSBiotech公司；流式細(xì)胞儀來自美國Bechman coulter Epics Altrag型；光學(xué)顯微鏡來自日本尼康公司；倒置相差顯微鏡來自日本奧林巴斯公司。

1.3 取材與細(xì)胞培養(yǎng) 手術(shù)無菌臺上取下角膜移植后的角膜環(huán)，應(yīng)用PBS液進行三次漂洗，并且對角膜上皮及內(nèi)皮進行多次刮除，置于0.25%胰酶溶液，在4℃冰箱消化過夜后，將角膜用剪刀剪碎成約1 mm見方的小塊，置于2 g/LⅡ型膠原酶溶液中，放置于37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h，等剪碎的角膜組織塊消化后，低速離心（800 r/min，10 min），應(yīng)用PBS進行1次漂洗加入DMEM培養(yǎng)基 （含胎牛血清20%，青霉素、鏈霉素均為100 μmol/mL，pH值7.2～7.4），吹打均勻后將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每3日換培養(yǎng)液1次。

1.4 設(shè)計分組 陰性對照組：不加Mat及Dxm。陽性對照組：（Dxm）終質(zhì)量濃度為1 mg/L。實驗組（Mat用藥組）：Mat終質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、160 mg/L。

1.5 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的測定 制備單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸混液在75 mL的培養(yǎng)瓶中接種，將細(xì)胞懸液瓶放在37℃、95%濕度、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，1 d后取出，加入不同的條件培養(yǎng)基，進行2 d的培養(yǎng)后，讓其消化成單細(xì)胞懸液后離心（800 r/min，6 min），放棄上清，應(yīng)用PBS進行多次清洗，而后進行離心（800 r/min，6 min），再次棄去上清，收集1×106以上的細(xì)胞，用終濃度為70%的冰乙醇進行固定，再應(yīng)用4℃冰箱固定1 d，再次應(yīng)用PBS漂洗3次，經(jīng)0.5 g/L的RnaseA消化30 min，終質(zhì)量濃度65 mg/L的碘化丙錠（PI）染色1 h后流式細(xì)胞儀測定，結(jié)果用Multicycle軟件計算細(xì)胞各時期細(xì)胞數(shù)百分比率，分析細(xì)胞周期，計算凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s），比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCFs的原代培養(yǎng) 膠原酶消化24 h后細(xì)胞貼壁，呈梭形，1周左右見細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，10 d后細(xì)胞漸融合。角蛋白陽性為角膜上皮細(xì)胞，傳代3代后，所有的細(xì)胞均表現(xiàn)為角蛋白陰性，則表明成纖維細(xì)胞中沒有角膜上皮的污染。見圖1。

圖1 HCFs圖片（200倍）

2.2 Mat對HCFs周期和凋亡的影響 見表1。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，10、20、40、80、160 mg/L Mat作用于HCFs 48 h后，與陰性對照組相比：G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目雖稍有增加，但與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而G2/M期的細(xì)胞數(shù)目增加，S期細(xì)胞數(shù)目減少，與對照組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著Mat濃度的增加，G2/M期的細(xì)胞數(shù)目進一步增加，而S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，這表明Mat對HCFs的細(xì)胞周期分布具有顯著調(diào)節(jié)作用。Dxm組與陰性對照組相比，G0/G1期明顯增加，S期明顯減少差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而G2/M期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果也表明，濃度為160 mg/L 的Mat作用細(xì)胞后可以引起明顯細(xì)胞凋亡（P＜0.05），而小于 80 mg/L的濃度則差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。DNA指數(shù)（DI）在各藥物濃度組間差異未有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 Mat和Dxm對HCFs細(xì)胞周期的影響（±s）

表1 Mat和Dxm對HCFs細(xì)胞周期的影響（±s）

與Dxm組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別n S陰性對照組 3 29.13±0.65 Dxm（1 mg/） 3 15.57±0.95△Mat（10 mg/） 3 24.13±1.04*△G0/G1 G2/M 60.50±1.70 11.40±0.66 72.67±1.47△11.77±0.90 59.63±1.16*16.23±1.38*△Mat（20 mg/） 3 23.30±1.59*△60.97±2.39 15.73±1.40*△Mat（40 mg/） 3 62.13±1.91 17.60±2.59*△20.23±3.39*△Mat（80 mg/） 3 61.53±3.66 19.80±1.81*△18.67±1.15*△Mat（160 mg/） 3 64.60±3.86 23.00±1.71*△12.57±1.37*△

表2 Mat和Dxm對HCFs細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表2 Mat和Dxm對HCFs細(xì)胞凋亡的影響（±s）

組別 n陰性對照組 3 Dxm（1 mg/） 3 Mat（10 mg/） 3 Apotosis（%） DI 1.78±0.37 1.01±0.01 1.51±0.34 1.02±0.00 1.88±0.33 1.02±0.03 Mat（20 mg/） 3 2.08±0.26 1.01±0.02 Mat（40 mg/） 3 1.99±0.28 1.01±0.03 Mat（80 mg/） 3 2.21±0.44 1.02±0.04 Mat（160 mg/） 3 8.64±1.21*△1.01±0.02

3 討 論

近年來隨著激光角膜屈光性手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，其治療效果已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同［10］。越來越多的人愿意選擇激光手術(shù)，但是術(shù)后haze的出現(xiàn)仍然是個不容忽視的問題。目前臨床上激光角膜屈光性手術(shù)后經(jīng)常應(yīng)用皮質(zhì)類固醇，但可引起高眼壓癥、繼發(fā)性青光眼、并發(fā)性白內(nèi)障的危險。為了減少這些不良反應(yīng)，近年來全球?qū)aze的發(fā)有了很多的研究［11-13］。

Wilson撰文表明，角膜的上皮損傷是造成角質(zhì)膜細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)原因，所以角膜愈合反應(yīng)的啟動因素是角膜細(xì)胞的凋亡［14］?？傊?，角膜成纖維細(xì)胞的增殖直接促成了haze的形成［15］。所以，預(yù)防激光角膜屈光性手術(shù)后haze的形成的有效方法是阻斷其增殖，從而提高手術(shù)的療效。

脫離了正常生存環(huán)境、在人體外培養(yǎng)的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞可以自行進行增殖，與體內(nèi)不同，而與在體激活的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞極其相似。角膜成纖維細(xì)胞在傳代后可獲大量細(xì)胞供研究使用，通過觀察Mat對體外培養(yǎng)的人角膜纖維細(xì)胞增殖的影響，來近似地了解苦參堿應(yīng)用于體內(nèi)激活角膜成纖維細(xì)胞的作用，為該藥的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗將10、20、40、80、160 mg/L的Mat和1 mg/L 的Dxm分別同時作用于HCFs 48 h后，用流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞周期和凋亡的變化，其結(jié)果顯示：1）低于160 mg/L濃度的Mat作用于HCFs 48 h后，G2/M期的細(xì)胞數(shù)目增加，S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，說明Mat使成纖維細(xì)胞合成DNA減少，同時還干擾有絲分裂前的準(zhǔn)備，阻礙有絲分裂的進行。而Dxm則表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞數(shù)目的增加，主要是抑制DNA的合成。2）DNA指數(shù)（DI）是衡量細(xì)胞是否為二倍體的一個指標(biāo)。在正常二倍體細(xì)胞中，DI值為（1.01±0.1）。當(dāng)DI＞1.1，表示細(xì)胞是異倍體；而當(dāng)DI＜0.9時，則為測試誤差。由DI指數(shù)來看，上述各組濃度Mat之間均未見顯著性差異，說明160 mg/L以下的質(zhì)量濃度對細(xì)胞沒有致畸變作用。3）藥物在80 mg/L以下時，對HCFs不產(chǎn)生明顯的凋亡，也就不會因為該細(xì)胞的過度凋亡而啟動角膜的過強愈合反應(yīng)。

Haze的形成主要原因是角膜成纖維細(xì)胞的增殖，所以我們所尋找的激光角膜屈光性手術(shù)后用藥必須是能抑制該細(xì)胞增殖的藥物，但是同時卻不能引起該細(xì)胞的凋亡，因為角膜組織不同于人體其他組織，各種原因所致的角膜成纖維細(xì)胞的凋亡反過來又會啟動角膜創(chuàng)面的愈合反應(yīng)，就此引起級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致更多的角膜成纖維細(xì)胞增殖，從而影響激光角膜屈光性手術(shù)的療效。

為了解決該矛盾，我們在發(fā)現(xiàn)了苦參堿對人角膜成纖維細(xì)胞呈時間-劑量依賴性抑制增殖后，還必須要篩選出合適的藥物作用濃度，在保證藥物有效抑制增殖的同時而不誘導(dǎo)明顯的凋亡。但是筆者在該實驗中是對體外培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞所做的處理，可能具體的藥物濃度還是會跟臨床用藥有所差異，故而該實驗結(jié)果還需進一步的動物實驗來完善。所以Mat是一種有可能成為極具潛力的激光角膜屈光性手術(shù)后的新型候選藥物，但其抑制增殖的機制和適宜的臨床用藥濃度還有待于更深入的研究。

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R969 文獻標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1549-03

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2016-03-23）