丹槐銀屑濃縮丸對實驗性銀屑病模型豚鼠免疫調節的影響*

黃 萍陳少秀陳德森吳勝英彭吉霞（.湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 44000；.湖北醫藥學院，湖北 十堰 44000）

丹槐銀屑濃縮丸對實驗性銀屑病模型豚鼠免疫調節的影響*

黃 萍1陳少秀1陳德森2△吳勝英2彭吉霞2
（1.湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察丹槐銀屑濃縮丸對豚鼠實驗性銀屑病病理改變及免疫系統調節的影響，探討其作用機制。方法 豚鼠40只，采用隨機數字法隨機分為模型組、維A酸組、丹槐低、中、高劑量組各8只，采用普萘洛爾溶液涂于豚鼠雙耳背側4周法造模，造模型成功后，維A酸組采用陽性藥維A酸乳劑于皮損雙耳涂藥，丹槐低、中、高劑量組用丹槐銀屑濃縮丸灌胃，模型組不處理。測定治療前后豚鼠靜脈血T淋巴細胞、紅細胞、白細胞、單核細胞數量，測定血清總蛋白、血紅蛋白、白蛋白含量，采用酶標雙抗體夾心ELISA法測定腫瘤壞死因子（TNF-α）、干擾素（IFN-γ）、細胞因子白介素-1（IL-1）、IL-2、IL-6、IL-8等水平。結果 模型組靜脈血T淋巴細胞、單核細胞、白細胞數量均有不同程度升高，血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白無明顯變化。維A酸組靜脈血T淋巴細、單核細胞，白細胞數量明顯降低，對體液免疫系統有抑制作用，豚鼠血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白含量降低，與模型組比較差異有統計學意義（均P＜0.05）。丹槐中、高劑量組治療后靜脈血T淋巴細、單核細胞，白細胞數量明顯降低，與本組治療前及模型組比較差異有統計學意義（均P＜0.05），其血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白有降低均勢，但與治療前比較差別不大（均P＞0.05），且丹槐中、高劑量組比較差別不大（均P＞0.05）。治療前后模型組白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在較高水平，說明白介素炎性因子是引起動物皮膚發生銀屑病樣病理改變的基礎。維A酸組白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低，與本組治療前及模型組比較差異有統計學意義（均P＜0.05）。丹槐中、高劑量組與維A酸組類似，其作用稍弱于維A酸，在治療后TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低，與本組治療前及模型組比較差異有統計學意義（均P＜0.05）。丹槐中、高劑量組比較差別不大（均P＞0.05）。模型組、維A酸組、丹槐低、中、高劑量組涂普萘洛爾的表皮均有類似于人類銀屑病樣改變，造模后出現明顯的皮損等病理學特征，治療前5組動物病理檢查均有表皮角質層過度角化，棘層變厚、釘突延長，真皮層出現中重度炎細胞浸潤，角質層血管炎、內有小膿腫等銀屑病性改變。治療后維A酸組皮損消失，表皮角化現象明顯減少，幾無炎細胞浸潤、表皮釘突及小膿腫消退。丹槐中、高劑量組皮損面積降低，但病理檢查仍有部分動物表皮有角化現象，角質層血管炎、小膿腫等銀屑病性較模型組及治療前明顯好轉。結論 丹槐銀屑濃縮丸可在不影響體液免疫的情況下降低實驗性銀屑病豚鼠細胞免疫反應，抑制TNF-α誘導細胞因子與IFN-γ之間的級聯反應，對白介素IL-1、IL-2、IL-6及IL-8等細胞因子介導的炎癥反應亦有明顯的抑制作用，可減輕炎癥反應，具有與維A酸類似藥理作用。

銀屑病動物模型 丹槐銀屑濃縮丸 細胞免疫 免疫調節

【Abstract】Objective：To observe the effect of dhyxnsw on regulation of guinea pig experimental psoriasis pathological changes and the immune system，to explore its mechanism of action.Methods：40 guinea pigs，were randomly divided into model group，A retinoic acid group，Dan Huai low，medium and high dose group.The propranolol solution was coated on the back side of the guinea pig ears for 4 weeks to model.And after successful modeling，A retinoic acid group with positive medicine a agent in lesions of binaural medicine，Dan Huai low，middle and high dose groups，with dhyxnsw gavage，compared model group without treatment.Before and after treatment，the venous blood T lymphocytes of guinea pig red blood cells，white blood cells，mononuclear cell number determination，determination of serum total protein，hemoglobin，albumin，tumor necrosis factor were determined by enzyme labeled by double antibody sandwich ELISA（TNF-α），interferon（IFN-γ），cytokine interleukin （IL-1），IL-2，-1 IL-6，IL-8 level.Results：dhyxnsw significantly decreased in the high dose group of Dan Huai，T lymphocytes，monocytes，TNF-α，IFN-γ，IL-1，IL-2，interleukin IL-6 and IL-8 secretion and synthesis also significantly inhibited，compared with the model group （P＜0.05），the difference was statistically significant，but Dan Huai in high dose group，the above indexes between two groups had no significant difference （P＞0.05）.Conclusion：dhyxnsw decreased cellular immunity in guinea pig psoriasis does not affect humoral immune reaction in the experimental conditions，the inhibition of TNF-α induced cascade reaction between cytokines and IFN-γ，also had an obvious inhibitory effect on the inflammatory reaction of interleukin IL-1，IL-2，IL-6 and IL-8 mediated by cytokines，reducing inflammation the reaction，with pharmacological action and similar A retinoic acid.

【Key words】dhyxnsw；psoriasis animal model；cell immunity；immune regulation

銀屑病發病多系外邪化熱入血造成機體過度反應，血熱、血瘀、血燥病癥并存乃現風熱濕之象［1］，該病治療有“治風先治血，血行風自滅”的觀點。近年來中草藥在臨床治療銀屑病有突出表現，其中筆者所在醫院應用具有清熱解毒、涼血活血、祛風止癢之功效的丹槐銀屑濃縮丸取得了較好療效［2］。該藥由丹參、槐花、柴草、赤芍、黃連、雞血藤地黃、白鮮皮、高青葉等諸藥調制成丸，其主要有效藥理成份為有丹參素、黃連素、丹參酮、小檗堿等。目前對該丸藥的系統研究較有限，且多局限于中醫理論探討，本實驗以現代醫學檢驗方法對其治療銀屑病進行了系統研究，以期探討其對免疫調節的影響，為臨床治療銀屑病提供實驗依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 豚鼠40只，體質量（300±50）kg，實驗動物由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物設施使用許可證SYXK（鄂）2011-0031，實驗動物生產許可證SCXK（鄂）2011-0008。動物房溫度22～26℃，濕度45%～75%，分籠飼養，自然光照，自由飲水，普通飼料喂養，每日觀察動物進食情況，稱體質量，及時清理糞便，本研究中動物處置方法符合動物倫理學標準［3］。

1.2 試藥及儀器 丹槐銀屑濃縮丸（黑龍江省中醫研究院醫院研制，規格1 g/丸，批號090801）；普萘洛爾片（江蘇常州亞邦制藥有限公司，批號040512）；阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司，10 mg，批號20010126）；兔VEGF共調節趨化因子1（VCC1）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司提供，批號mi028457）。提取mRNA試劑及反轉錄試劑（美國Invitrogen公司提供）。

1.3 分組與造模 銀屑病動物模型 40只豚鼠隨機數字表編號分為模型組，維A酸組，丹槐低、中、高劑量組各8只。參照文獻［4］，造模前將普萘洛爾片研碎配制成5%的水溶液備用，丹槐銀屑濃縮丸研碎配制成10%的水溶液。造模時模型組，阿維A組，丹槐低、中、高劑量組5組動物雙耳剃毛，用5%普萘洛爾水溶液均勻涂于雙側耳背，面積以11 cm，厚度1 mm為宜，每日1次，連續涂4周，以雙耳涂藥處出現銀屑病樣皮損為造模成功，空白對照組涂0.9%氯化鈉注射液。本實驗造模均出現銀屑病樣皮損，成功率100%。

1.4 給藥方法 造模成功后，維A酸組按［1 mL/（kg·d）］用陽性藥維A酸乳劑于皮損雙耳涂藥，丹槐低、中、高劑量組用丹槐銀屑濃縮丸灌胃［低、中、高劑量按5、10、20 mL/（kg·d）］，4組動物均連續治療4周，模型組不處理作為對照。治療過程中觀察動物皮損部位病理改變，結束后取病變組織做病理學檢查，如表皮角質層是否角化，釘突及棘層病理改變情況。

1.5 標本采集與檢測 參照文獻［5］，于治療前后分別經耳緣靜脈取血測定治療前后豚鼠靜脈T淋巴細胞、血紅細胞、白細胞，單核細胞數量，血清總蛋白、血紅蛋白、白蛋白含量，采用酶標雙抗體夾心ELISA法腫瘤壞死因子（TNF-α）、干擾素（IFN-γ）及白介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-8等［6］。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件處理。計量資料實驗數據均以（±s）表示，兩組間的均數檢驗采用多因素方差分析，組間構成比差異檢驗采用χ2檢驗，相應的多因素分析分別采用雙向方差CMH χ2檢驗。兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組免疫指標水平比較 見表1。模型組靜脈血T淋巴細胞、單核細胞、白細胞數量均有不同程度升高，血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白無明顯變化。維A酸組靜脈血T淋巴細、單核細胞，白細胞數量明顯降低，對體液免疫系統有抑制作用，豚鼠血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白含量降低，與模型組比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。丹槐中、高劑量組治療后靜脈血T淋巴細、單核細胞，白細胞數量明顯降低，與本組治療前及模型組比較，差異有統計學意義（均P＜0.05），其血清總蛋白、白蛋白及血紅蛋白有降低均勢，但與治療前比較差別不大（均P＞0.05），且丹槐中、高劑量組比較差別不大（均P＞0.05），說明丹槐銀屑濃縮丸對體液免疫系統無抑制作用。

表1 各組免疫指標水平比較（±s）

表1 各組免疫指標水平比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

血紅蛋白（g/100 mL）11.39±2.87 14.64±7.32 12.24±2.13 15.52±6.39 12.66±2.70 14.91±2.25 （n=8） 治療后8.59±0.84 9.94±2.12*△1.75±0.30*△43.76±5.67*△10.21±2.20*△9.27±2.24*△10.21±3.29*△丹槐低劑量組治療前8.54±0.74 12.27±2.16 2.57±0.25 75.37±6.49 15.54±2.98 12.73±2.20 15.54±1.98 （n=8） 治療后8.83±0.85 11.20±2.32 2.30±0.26 71.37±6.01 14.74±2.18 11.27±1.96 15.74±2.18丹槐中劑量組治療前8.56±0.79 12.27±2.21 2.27±0.27 77.24±6.49 15.54±1.98 12.73±2.20 15.54±1.98 （n=8） 治療后8.83±0.85 9.20±2.19*△1.60±0.22*△53.30±5.06*△14.79±2.32 10.45±1.74 13.74±2.59丹槐高劑量組治療前8.39±0.71 12.15±2.24 2.39±0.23 72.27±4.26 16.22±3.42 11.50±2.59 15.22±3.12 （n=8） 治療后8.41±0.87 9.36±2.09*△1.54±0.31*△49.79±5.35*△14.97±3.93 10.27±3.45 14.63±3.97組別 時間 紅細胞（個/μL）白細胞（個/μL）白蛋白（g/100 mL）模型組 治療前（n=8） 治療后維A酸組 治療前單核細胞（%）8.28±0.74 12.21±2.17 2.32±0.22 8.93±0.77 16.20±2.54*4.30±0.24*8.37±0.83 12.32±3.33 2.59±0.31 T淋巴細胞（%）70.10±5.65 78.37±6.87*69.59±5.98總蛋白（g/100 mL）15.64±2.36 16.52±2.31 14.91±2.17

2.2 各組TNF-α、IFN-γ及白介素比較 見表2。治療前后模型組TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在較高水平，說明白介素炎性因子是引起動物皮膚發生銀屑病樣病理改變的基礎。維A酸組TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低，與本組治療前及模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。丹槐中、高劑量組與維A酸組類似，其作用稍弱于維A酸，在治療后TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低，與本組治療前及模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。丹槐中、高劑量組比較差別不大（P＞0.05）。

表2 各組TNF-α、IFN-γ及白介素水平比較（±s）

表2 各組TNF-α、IFN-γ及白介素水平比較（±s）

IL-8β （pg/mL）81.39±9.80 83.27±8.24 82.20±9.02 （n=8） 治療后 18.±1.82*△14.9±2.32*△30.7±4.30*△53.7±5.02*△43.2±4.29*△61.2±7.22*△丹槐低劑量組 治療前 42.70±5.21 33.21±4.804 62.79±7.55 76.10±7.62 66.01±7.37 80.73±8.78 （n=8） 治療后 38.80±4.81 29.22±3.30 55.30±6.22 71.87±7.68 64.74±7.12 79.27±8.21丹槐中劑量組 治療前 41.52±5.79 32.27±2.21 63.27±0.27 77.20±7.40 65.54±1.98 82.73±2.20 （n=8） 治療后 29.81±2.82*△22.20±2.97*△40.60±4.27*△55.30±6.14*△44.79±5.30*△67.27±7.54*△丹槐高劑量組 治療前 43.31±5.76 32.15±3.27 62.32±7.29 75.20±8.20 66.29±7.47 81.51±9.55 （n=8） 治療后 28.49±2.96*△21.36±2.74*△39.54±3.90*△56.79±6.02*△45.39±5.75*△66.27±7.02*△組別 時間IL-1β （pg/mL）43.28±5.74 32.21±4.19 62.72±7.29 45.34±5.87 33.25±4.19 64.35±7.24 44.78±5.85 34.21±4.84 62.79±7.52 TNF-α （ng/mL）IFN-γ （μg/mL）模型組 治療前（n=8） 治療后維A酸組 治療前IL-2β （pg/mL）77.17±7.64 75.37±7.80 76.10±7.67 IL-6β （pg/mL）65.60±7.32 67.52±7.39 66.65±7.37

2.3 病理改變觀察 模型組、維A酸組、丹槐低、中、高劑量組涂普萘洛爾的表皮均有類似于人類銀屑病樣改變，造模后出現明顯的皮損等病理學特征，治療前5組動物病理檢查均有表皮角質層過度角化，棘層變厚、釘突延長，真皮層出現中重度炎細胞浸潤，角質層血管炎、內有小膿腫等銀屑病性改變。治療后維A酸組皮損消失，表皮角化現象明顯減少，幾無炎細胞浸潤、表皮釘突及小膿腫消退。丹槐中、高劑量組皮損面積降低，但病理檢查仍有部分動物表皮有角化現象，角質層血管炎、小膿腫等銀屑病性較模型組及治療前明顯好轉。

3 討 論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是一具有泛發性、易復發性、頑固性特點的表皮細胞增殖過快及角化不全慢性炎癥性皮膚病。銀屑病的病理基礎與鏈球菌感染、遺傳、自身免疫異常相關，發病多與T淋巴細胞過度增殖、炎癥因子介導的炎癥反應、內分泌失調、精神、神經因素等均有關［7］。最新研究表明自身免疫異常是其主要誘因，T淋巴細胞可驅動皮損表皮病理改變，其過度增殖及細胞因子介導的炎癥反應常用引起皮乳頭微血管的異常增生，表皮細胞增殖過快和角化不全、毛細血管擴張均可加重銀屑病皮損及病理進程［8］。近年來研究發現通過免疫調節，抑制過度免疫反應有明顯療效的治療作用。

目前多數學者認為TNF-α由由皮損部位表皮細胞產生，如角質形成細胞、T細胞、中性粒細胞、單核細胞等［9］。TNF-α能誘導細胞因子如白介素和IFN-γ產生級聯反應，TNF-α直接或間接通過細胞因子白介素產生IFN-γ，而IFN-γ在銀屑病的發生發展中起到至關重要的介導作用［10］。白介素全稱白細胞介素，分析15種亞型，如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等，是白細胞或免疫細胞間相互作用的細胞因子在傳遞信息激活與調節免疫細胞介導T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用，是重要的炎癥介質。IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等是機體重要炎癥介質，可在機體感染及其他無菌性炎癥反應時誘導激活T、B淋巴細胞分化，增加中性粒細胞溶酶體酶的活性及T、B淋巴細胞、單核巨噬細胞的吞噬功能。銀屑病的發病機制目前嘗無定論，多數學者更傾向于銀屑病是由T淋巴細胞介導，T淋巴細胞的異常增殖常導致紅斑鱗屑性皮膚?。?1］，刺激真皮乳頭微血管的異常增生進而加重銀屑病發生發展，導致嚴重皮損。亦有學者銀屑病是由自分泌型血管內皮生長因子增多造成，血管內皮生長因子是一種高度特異性的促血管生長因子，銀屑病患者血管內皮生長因子及其受體HIT-l、KDR均出現過度表達［12］。

在治療4周后，與模型組比較，丹槐中、高劑量組T淋巴細胞、單核細胞數、TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低，提示丹槐銀屑濃縮丸可能通過抑制TNF-α誘導細胞因子與IFN-γ之間的級聯反應，降低T淋巴細胞分化，下調IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等，干預炎癥細胞及單核巨噬細胞過多進入表皮及真皮以下組織，阻斷IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等介導激活單核巨噬細胞活化及炎性浸潤，避免表皮由于炎癥反應出現皮損。觀察發現，模型組靜脈血T淋巴細胞、單核細胞、白細胞數量及白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在高水平，這說明細胞免疫系統T淋巴細胞及細胞因子與銀屑病確有明確的相關性。陽性藥維A酸為抗皮膚角化異常藥，其藥理作用主要是抑制T細胞增殖及表皮I型轉谷氨酰胺酶、促進角質形成細胞分化，同時也有抑制角質形成細胞增殖、抑制白細胞趨化性，具有調節表皮細胞分化和增殖等作用［13］。維A酸組治療后異常增殖T淋巴細胞明顯降低，佐證阿維A確有抑制T細胞增殖的作用。丹槐中、高劑量組治療后作用與維A酸組類似，其靜脈血T淋巴細胞、單核細胞、白細胞數量及TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明顯降低。在本方中，君藥紫草味苦性寒，可涼血清熱；臣藥黃連、白鮮皮、高青葉可清熱解毒，尤其黃連的有效成份黃連素、小檗堿具有確切的清熱解毒、抗炎清腫之功效［14-15］；雞血藤及丹參佐藥皆為上等活血良藥，《吳普本草》記載丹參味辛性涼，其有效成份丹參酮、丹參素具有活血化瘀，松弛血管平滑肌改善微循環的作用［16］。白茅根涼血生津清熱利水，澤瀉甘寒泄熱毒，以上君臣諸藥可疏通膚絡、清泄熱毒、清熱解毒、涼血活血而達到祛屑止癢之目的。從實驗結果來看，丹槐銀屑濃縮丸可在不影響體液免疫的情況下降低實驗性銀屑病豚鼠細胞免疫反應，抑制TNF-α誘導細胞因子與IFN-r之間的級聯反應，對白介素IL-1、IL-2、IL-6及IL-8等細胞因子介導的炎癥反應亦有明顯的抑制作用，可減輕炎癥反應，具有與維A酸類似的免疫調節藥理作用。

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Effect of Dhyxnsw Regulation on Experimental Psoriasis Model of Guinea Pig Immunity

HUANG Ping，CHEN Shaoxiu，CHEN Desen，et al.Shiyan Taihe Hospital affiliated to Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1508-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.015

湖北省教育廳重點項目（D20092404）

（電子郵箱：yanzhenqiangyzq@163.com）

2016-03-05）