外感清熱解毒方對發(fā)熱大鼠血清炎癥因子與下丘腦環(huán)氧化酶1和2蛋白表達的影響*

平 鍵成 揚△麥靜愔奚 安陳建杰（.上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院，上海 20299；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 2020；.上海浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 20299）

·研究報告·

外感清熱解毒方對發(fā)熱大鼠血清炎癥因子與下丘腦環(huán)氧化酶1和2蛋白表達的影響*

平 鍵1，2成 揚1，2△麥靜愔3奚 安3陳建杰1
（1.上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院，上海 201299；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；3.上海浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201299）

目的 觀察外感清熱解毒方對發(fā)熱大鼠血清中炎癥因子和下丘腦環(huán)氧化酶1和2蛋白表達的影響。方法 雄性SD大鼠46只隨機分為正常對照組8只和造模組38只；造模組予干酵母混懸液皮下注射，正常組注射0.9%氯化鈉注射液。注射6 h后，造模組剔除6只升溫＜0.8℃的大鼠，剩余32只大鼠隨機分成模型對照組、陽性對照組、中藥低劑量組和高劑量組，各8只。正常對照組和模型對照組予蒸餾水，陽性對照組予阿司匹林混懸液，中藥組予相應劑量的中藥灌胃。4 h后處死大鼠，分離血清，ELISA法檢測炎癥因子含量；取下丘腦組織，Western blot法檢測環(huán)氧化酶1和2蛋白表達水平。結(jié)果 陽性對照藥物和中藥干預均降低了發(fā)熱大鼠的體溫，下降幅度由大到小依次為陽性對照組、高劑量組和低劑量組。與模型組相比較，陽性對照組、低劑量組和高劑量組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高、低劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和中藥組血清白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β水平均顯著下降（P＜0.01），高和低劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比較，陽性對照組和中藥組顯著抑制了下丘腦組織中環(huán)氧化酶2的蛋白水平表達（P＜0.01），低劑量和和高劑量之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組下丘腦組織中環(huán)氧化酶1表達則沒有明顯變化。結(jié)論 外感清熱解毒方能有效降低發(fā)熱大鼠的體溫，其機制與降低血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平、抑制下丘腦組織中環(huán)氧化酶2的表達有關(guān)。

外感清熱解毒方 發(fā)熱 炎癥因子 環(huán)氧化酶1和2

【Abstract】Objective：To study the effect of Waigan Qingre Jiedu decoction on serum inflammatory factors and protein expression of COX-1 and COX-2 in Hypothalamus in fever rats.Methods：Body temperature of 50 male SD rats was measured once per hour，continuous twice；taking the average as the basic body temperature.After removing 4 rats with the temperature difference＞0.3℃，the rest 46 rats were randomly divided into the normal control group（8 rats）and the model group（38 rats）.The model was reproduced with subcutaneous injection of dry yeast suspension，and normal saline was injected in the normal group.6 h after injection，6 rats that heated up＜0.8℃was removed from the model group.The remaining 32 rats were randomly divided into the model control group，the positive control group，low-dose group and high-dose group，8 rats in each group.The normal control group and the model control group were given distilled water；the positive control group were given aspirin suspension，and low and high-dose groups were given Waigan Qingre Jiedu decoction.4h after drug administration，the rats were killed；serum was separated.ELISA was used to detect inflammatory factors；hypothalamus was collected to detect Cyclooxygenase 1 and 2 by Western blot.Results：Both positive drug and Waigan Qingre Jiedu decoction decreased the temperature of fever rats，and decrease magnitude was the positive control group，highdose group and low-dose group.Compared with the model group，the difference among the positive control group，low-dose group and high-dose group was statistically significant（P＜0.01）.There was significant difference between high-dose and low-dose groups（P＜0.05）.Compared with the model group，the levels of IL6，IL6，TNF and IL1 dropped obviously in the positive control group and TCM group（P＜0.01）.There was significant difference between high-dose and low-dose groups（P＜0.05）.Compared with the model group，Waigan Qingre Jiedu decoction significantly inhibited Cyclooxygenase 2 expression in the hypothalamus（P＜0.01），and there was no significant difference between the low-dose and high-dose groups（P＞0.05）.There was no significant change in Cyclooxygenase 1 expression in the hypothalamus of all groups.Conclusion：Waigan Qingre Jiedu decoction can effectively reduce the body temperature of fever rats，which associated with reduction of serum IL-6，TNF alpha and IL-1 beta level，and inhibition of expression of cyclooxygenase-2 in hypothalamic tissue.

【Key words】Waigan Qingre Jiedu decoction；Fever；Inflammatory factors；Cyclooxygenase 1 and 2

發(fā)熱是指體溫高于正常值范圍，既是患者的主觀癥狀，也是可以客觀檢測到的體征。外感發(fā)熱常見于感冒和時行感冒，作為對人體危害較大的多發(fā)病，受到歷代醫(yī)家的重視［1］。外感清熱解毒方系上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院從 2003年開始在防治 SARS、H1N1、H5N1、H7N9等幾次疾病過程中，結(jié)合中醫(yī)理論和臨床實踐擬定的經(jīng)驗方，在歷次疫情發(fā)熱患者中大量使用，取得了良好的療效［2-3］。本研究以干酵母皮下注射誘導大鼠發(fā)熱模型，觀察該方對外周血中炎癥因子和下丘腦組織中環(huán)氧化酶1和2表達的影響，探討其退熱的作用機制，為進一步開發(fā)安全有效的中藥制劑提供依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量（170±10）g，購自上海西普爾-必凱公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 藥物 參考文獻［2］，外感清熱解毒方由黃芩、桔梗、蘆根、炙款冬、蒼術(shù)等組成。按比例稱取單味中藥在蒸餾水中浸泡30 min，并加入100 mL蒸餾水（液面浸沒中藥飲片2～3 cm）武火煮沸，待其沸騰后文火慢煎30 min，得濾液50 mL左右；再向生藥中繼續(xù)加入蒸餾水至藥材表面再次進行煮沸，得濾液50 mL左右，將2次濾液合并后濃縮至50 mL左右，并將其放入4℃冰箱冷卻，靜置過夜，次日繼續(xù)濃縮至25 mL，2000×g離心，取上清液制備藥液（含生藥量1 g/mL），低溫冷藏備用。阿司匹林泡騰片購自阿斯利康制藥有限公司，配成0.5%的混懸液（含藥量0.005 g/mL）。干酵母購自安琪酵母有限公司，制備20%干酵母混懸液備用。

1.3 試劑與儀器 BCA試劑盒購自碧云天生物公司。抗環(huán)氧化酶1和2多克隆抗體購自美國EPITOMICS公司。抗GAPDH抗體購自康成生物。Odyssey IRDye 680 conjugated山羊抗兔IgG、Odyssey Blocking Buffer均產(chǎn)自美國Li-Cor公司。Nonidet P40產(chǎn)于美國SIGMA-ALDRICH公司，PMSF購自美國Fluka公司。完全性蛋白酶抑制劑混合物為德國Roche公司產(chǎn)品；40% Acrylamide/bis Solution［N，N’-Methylenbis-acrylamid， Mix，Ratio 37.5∶1（2.6%C）］和Tween-20購自美國Bio-Rad公司。預染蛋白標準品產(chǎn)于加拿大Fermentas公司。硝酸纖維薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS為美國Amresco產(chǎn)品。異丙醇、溴酚藍購自上海試劑三廠。過硫酸銨、甲醇、濃鹽酸均為分析純，購自中國國藥集團化學試劑有限公司。Odyssey紅外掃描系統(tǒng)為Li-Cor公司產(chǎn)品。IL-6、TNF-α和IL-1β試劑盒購自豐恒生物科技公司。

1.4 造模與給藥 參考文獻 ［4］，50只大鼠適應環(huán)境3 d后，每日上午8點開始用電子體溫計測大鼠肛內(nèi)溫度2次，連續(xù)7 d。實驗前禁食不禁水12 h，實驗日上午8時開始每小時測體溫1次，連續(xù)2次，選取2次體溫的平均值作為正常大鼠基礎(chǔ)體溫，剔除4只溫差＞0.3℃者，剩余體溫合格大鼠46只，隨機分為正常組8只和造模組38只。參考文獻［4］，造模組大鼠于背部注射20%干酵母混懸液 （1 mL/100 g）制備發(fā)熱模型，正常組注射等量0.9%氯化鈉注射液，剔除6只6 h后升溫＜0.8℃者。剩余32只大鼠隨機分成模型對照組、陽性對照組、低劑量中藥組和高劑量中藥組，各組8只。造模6 h后，大鼠灌胃給藥，中藥組予外感清熱解毒方灌胃給藥 （高劑量和低劑量分別為60 kg成人體質(zhì)量用量的16倍和8倍）。陽性對照組予阿司匹林（0.005 g/100 g）灌胃，正常對照組和模型對照組予等量蒸餾水灌胃。

1.5 標本采集與檢測 1）大鼠體溫變化。從造模開始，每1小時測量大鼠肛溫1次直至實驗結(jié)束。計算體溫變化（體溫變化值Δ℃=各時點體溫-基礎(chǔ)體溫）。2）標本采集。灌胃給藥4 h后，最后1次測量體溫，用3%戊巴比妥鈉2 mL/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射，麻醉后的大鼠打開腹腔，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清，放置-80℃冰箱內(nèi)儲存。用鍘刀將大鼠頭部鍘下，左手將大鼠頭部固定好，隨后用右手持手術(shù)剪將大鼠頭部的皮剪開，再用手術(shù)剪將大鼠頭頂?shù)墓巧w沿中線剪開，再用手術(shù)剪撬至中線兩邊，將鼠腦翻轉(zhuǎn)，以大鼠腦灰結(jié)節(jié)和視交叉的中心點為界定部分，取出下丘腦組織于液氮中保存待測。3）血清細胞因子檢測。按照試劑盒提供的操作說明，檢測大鼠血清中白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β和IFN的含量。4）Western blot檢測。參考文獻［5-6］，采用RIPA試劑分離下丘腦總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加Odyssey blocking buffer封閉，加入1抗（環(huán)氧化酶1或2，工作濃度1∶1000），4℃下?lián)u床振蕩過夜，洗滌后加入2抗反應。洗滌后將膜置于Odyssey儀器上掃描、分析，使用內(nèi)參照GAPDH校正目標蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，采用ANOVA程序進行單因素方差分析，并用LSD程序進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體溫變化 見表1。在給予干酵母皮下注射6 h后，與正常組相比，各組大鼠體溫顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；除正常組外，其余各組之間體溫差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明造模成功，各干預組具有可比性。給藥4 h后，正常組體溫無明顯波動，模型組體溫維持較高水平。陽性對照藥物和中藥干預均降低了發(fā)熱大鼠的體溫，下降幅度大小依次為陽性對照組、高劑量組和低劑量組。與模型組相比較，陽性對照組、低劑量組和高劑量組均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。高劑量組與低劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體溫比較（Δ℃，±s）

表1 各組大鼠體溫比較（Δ℃，±s）

與正常組相比較，*P＜0.01。與模型組相比較，△P＜0.01。與低劑量組相比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組大鼠血清炎癥細胞因子水平比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組和中藥組上述細胞因子水平均顯著下降 （P＜0.01），高和低劑量組差異有顯著性（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠下丘腦組織中環(huán)氧化酶1和2的表達水平 見圖1和表3。Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組大鼠下丘腦組織中環(huán)氧化酶2蛋白表達量顯著上升（P＜0.01）。與模型組相比較，陽性藥物對該蛋白表達無影響（P＞0.05）。中藥干預則顯著抑制了該蛋白的表達（P＜0.01），高劑量和低劑量組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠下丘腦組織中環(huán)氧化酶1表達則沒有明顯變化。

表2 各組大鼠血清炎癥細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清炎癥細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

與正常組相比較，*P＜0.01；與模型組相比較，△P＜0.01；與陽性對照組比較，★P＜0.05；與低劑量組相比較，▲P＜0.05。下同。

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圖1 各組大鼠下丘腦組織環(huán)氧化酶1和2的表達水平

表3 各組大鼠下丘腦環(huán)氧化酶1和2表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠下丘腦環(huán)氧化酶1和2表達水平比較（±s）

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3 討 論

中醫(yī)藥在防治外感熱病方面有著悠久的歷史，明代《瘟疫論》對瘟疫的病因病機、診斷和治療做了全面論述，認為瘟疫是感受“癘氣”所致，治療重在祛邪，以“在衛(wèi)汗之可也”“治上焦如羽，非輕莫舉”為原則。對于外感病的治療著眼于整體，而不是單純抗病毒，遵循“整體觀念、辨證論治”的原則，尋求病毒侵襲機體后患者表現(xiàn)出的共性規(guī)律［7］。

外感清熱解毒方系本單位從2003年開始在防治歷次新發(fā)（發(fā)熱）呼吸道傳染病的過程中，結(jié)合中醫(yī)理論和臨床實踐擬定的經(jīng)驗方。本課題組認為外感發(fā)熱主因外感時行邪氣所致，邪氣由皮毛而入，侵襲氣道，營衛(wèi)不和，固見發(fā)熱、咽紅不適，郁熱熏蒸于肺衛(wèi)、灼傷肺陰，以致輕咳少痰，身熱無汗。故宜清熱解毒、解表宣肺。方中諸藥相合，共奏清熱解毒、疏散上焦之風熱、解表宣肺、除煩利咽之功。

在前期臨床研究證實，該方可以有效地提高外感發(fā)熱患者4 h即刻退熱療效，起效時間和退熱時間均顯著縮短，臨床痊愈率得到了顯著提高，在治療過程中沒有觀察到明顯不良反應［3］。為了進一步驗證該方的解熱作用，本實驗采用經(jīng)典的干酵母皮下注射的方法復制大鼠實驗性發(fā)熱模型，該模型具有操作簡便，重復性好，持續(xù)時間長等諸多優(yōu)點［8］。

本研究觀察到大鼠造模6 h后，大鼠體溫升溫1.79℃左右，與報道相符［9］。經(jīng)中藥和阿司匹林干預后，大鼠體溫均明顯下降，且高劑量組下降程度優(yōu)于低劑量組，提示該方解熱作用有劑量依賴性趨勢。

IL-1β、IL-6和TNF-α均是與炎癥密切相關(guān)的細胞因子，致病刺激因素可作用于巨噬細胞等，從而產(chǎn)生此類細胞因子，參與機體的免疫調(diào)節(jié)，細胞的增殖與凋亡，介導炎癥反應等。在機體的發(fā)熱反應中，這些細胞因子經(jīng)過血液循環(huán)進入宿主下丘腦影響體溫調(diào)節(jié)中樞，然后經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導，使產(chǎn)熱增多，從而促使體溫升高［10-12］。本實驗觀察到經(jīng)干酵母皮下注射刺激，可明顯誘導大鼠血清中TNF-α和IL-1β、IL-6含量增加，經(jīng)中藥干預，這些細胞因子均明顯下降，提示該方的解熱作用與降低血清中這些炎癥細胞因子含量有關(guān)。

環(huán)氧化酶又稱前列腺素H合成酶，是一種膜結(jié)合蛋白，是花生四烯酸代謝途徑中合成各種前列腺素和血栓素的關(guān)鍵限速酶，兼有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶的雙重功能［13］。該酶廣泛參與機體的多種生理及病理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機制、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等［14］。環(huán)氧化酶有3種異構(gòu)體，其中環(huán)氧化酶1是參與正常生理功能酶，環(huán)氧化酶3主要功能是產(chǎn)生前列腺素家族中的抗炎成分［15］。而環(huán)氧化酶2是誘導酶，在炎癥因子的刺激下可以大量表達，繼而促進前列腺素的合成增多，介導發(fā)熱、炎癥和疼痛等反應，是調(diào)控發(fā)熱過程的關(guān)鍵蛋白，研究表明環(huán)氧化酶是解熱藥物的重要靶點［16-17］。

本研究采用Western blot方法檢測了大鼠下丘腦組織中環(huán)氧化酶和2的表達水平，顯示各組大鼠下丘腦組織中環(huán)氧化酶1表達無明顯變化，而干酵母造模大鼠的環(huán)氧化酶2表達明顯增高，而外感清熱解毒方干預后，其表達水平顯著降低，提示該復方可以通過降低其表達而發(fā)揮抗炎解熱作用。

采用有效的中藥方治療外感發(fā)熱，既對感染控制有積極意義，又可以調(diào)節(jié)人體免疫機能，比單一抗病毒或者退熱藥物更具有優(yōu)勢［18］。本研究實驗結(jié)果顯示，外感清熱解毒方能明顯抑制發(fā)熱大鼠的體溫上升，降低體內(nèi)炎癥因子，抑制下丘腦中組織中環(huán)氧合酶2蛋白的表達，其機制值得進一步深入研究。

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Effects of Waigan Qingre Jiedu Decoction on Serum Inflammatory Factors and Protein Expression of COX-1 and COX-2 in Hypothalamus in Fever Rats

PING Jian，CHENG Yang，MAI Jingyin，et al.Infectious Disease Hospital of Pudong，Shanghai 201299，China.

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1496-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.012

上海市中醫(yī)藥事業(yè)三年行動計劃項目（ZY3-JSFC-1-1011）；上海市中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才建設(shè)項目學術(shù)共同體項目 （ZY3-RCPY-1-1001）；上海市浦東新區(qū)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展專項資金項目（PDYNZJ2014-08）；陳建杰上海市名中醫(yī)工作室項目（ZYSNXD-CC-MZY003）

（電子郵箱：drchengyang@126.com）

2016-04-11）