苦酸通方對自發性2型糖尿病胰島素抵抗大鼠體質量與腹部脂肪組織中FAS表達的影響*

金美英 高勝男 樸春麗（長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130117）

·研究報告·

苦酸通方對自發性2型糖尿病胰島素抵抗大鼠體質量與腹部脂肪組織中FAS表達的影響*

金美英 高勝男 樸春麗△
（長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130117）

目的 觀察苦酸通調方對自發性2型糖尿病胰島素抵抗大鼠體質量及腹部脂肪中脂肪酸生成酶（FAS）蛋白表達的影響。方法 以30只雄性ZDF大鼠為實驗對象，利用高脂飼料飼養，以12周周齡形成2型糖尿病大鼠模型。按體質量隨機分為3組，分別為模型組、吡格列酮治療組、苦酸通調方治療組各10只。正常對照組為其同系雄性非糖尿病Zucker Lean（ZL）大鼠10只，其中空白組以普通飼料喂養。并用Western blot法，檢測各組大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達情況。結果 1）經藥物治療12周后，模型組、吡格列酮組、苦酸通調組體質量均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。治療8周、12周后，苦酸通調組體質量與模型組相比明顯下降，吡格列酮組與模型組相比差異無統計學意義（P>0.05）。2）腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達情況：與正常組比較，模型組FAS蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。吡格列酮組和苦酸通調組明顯降低FAS蛋白表達，與模型組比較有明顯改善（P＜0.01）。結論 1）苦酸通調方具有減輕體質量，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗的作用。2）苦酸通調方組可明顯降低腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達，實驗結果說明2型糖尿病的糖脂代謝紊亂與FAS有關聯。苦酸通調方可以通過對體內合成脂肪途徑中的關鍵酶之一FAS起抑制作用，減少脂肪沉積，控制脂肪合成、減少體質量。FAS可能是苦酸通調方的作用新靶點，其機制可能與干預機體內脂肪組織的合成、分解代謝、進而改善胰島素抵抗作用有關。

苦酸通調方 2型糖尿病 胰島素抵抗 體質量 脂肪酸合成酶

【Abstract】Objective：To observe impacts of the Kusuan Tongtiao decoction on on FAS expression in abdominal adipose tissue of spontaneous type 2 diabetes mellitus in rats with insulin resistance.Methods：30 male Zucker Diabetes Fat（ZDF）rats were selected as experimental subjects，fed with high-fat diet for twelve weeks to form type 2 diabetic rats.They were randomly divided into three groups，namely，the model group，Pioglitazone treatment group，Kusuan Tongtiao decoction group，10 cases in each.The control group of non-diabetic male included 10 Zucker Lean（ZL）rats and the blank group were fed with normal diet.FAS protein expression of the abdominal adipose tissue of rats was detected with western blot method.Results：1）After 12 weeks of treatment，the weight of the model group，pioglitazone group and Kusuan Tongtiao decoction group were significantly higher than the control group（P＜0.01）.8 weeks or 12 weeks after treatment，body weight of Kusuan Tongtiao decoction group significantly decreased compared with the model group.There was no significant difference between pioglitazone group and the model group（P>0.05）.2）The expression of FAS protein in abdominal adipose tissue：compared with the normal group，FAS protein expression of the model group was significantly increased（P＜0.05）.FAS protein expression of Pioglitazone group and Kusuan Tongtiao decoction group significantly reduced，compared with model group，which was significantly improved（P＜0.01）.Conclusion：1）Kusuan Tongtiao decoction has an effect on improving insulin sensitivity and insulin resistance.2）Kusuan Tongtiao decoction can significantly reduce FAS protein expression of abdominal adipose tissue.The experimental results show that the disorder of glucose and lipid metabolism in type 2 diabetes mellitus is related to FAS.Kusuan Tongtiao decoction can inhibit FAS，one of

the key enzymes in the body fat pathway，reduce fat deposition，control fat synthesis，and reduce body weight.FAS may be a new target for its effect，whose mechanism may be related to the synthesis，decomposition and metabolism of adipose tissue in the body，and then to improve insulin resistance.

【Key words】Kusuan Tongtiao decoction；Type 2 diabetes mellitus；Insulin resistance；Weight；FAS

2 型糖尿病（T2DM）是一個典型的現代不良生活方式疾病，往往存在著脂代謝紊亂、肥胖、糖耐量異常等問題，肥胖是這些問題的基礎，它的發病是可以預見的。大量研究表明，肥胖是胰島素抵抗的獨立危險因素，肥胖時，脂肪組織結構和功能紊亂，失調的脂肪組織是連接胰島素抵抗、T2DM和動脈粥樣硬化的橋梁［1］。近年來研究發現，脂肪組織不僅是能量儲存器官，還是一個可以分泌產生多種激素和細胞因子的新的內分泌器官，它可以合成和釋放大量脂肪因子。脂肪酸合成酶（FAS）作為脂肪代謝的主要酶，含有脂肪酸合成所需的全部酶活性，其表達的改變可能是肥胖、2型糖尿病發生的分子基礎之一，從而進一步降低了胰島素的敏感性，誘發肥胖向2型糖尿病的轉化與發展［2］。脂肪酸合成酶很可能是體內調節能量消耗和儲存的重要位點之一。近年來大量研究表明，脂肪酸合成酶抑制劑C75和淺藍菌素具有減少小鼠進食量，增加能量消耗、降低體質量、預防胰島素抵抗的作用［3-6］。

中醫藥對于2型糖尿病的發生和控制2型糖尿病的進展有十分重要的意義，因此深入開展中醫藥從整體觀改善肥胖及胰島素抵抗，具有廣泛前景。本研究以中醫理論為指導，在已有前期研究的基礎上，以高脂飼料誘導的T2DM大鼠為實驗對象，觀察苦酸通調方對大鼠體質量、FAS蛋白相關表達有影響，尋找改善大鼠胰島素抵抗新靶點。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級9周齡雄性ZDF大鼠42只（體質量244～291 g）和同周齡雄性ZL大鼠10只（體質量183～220 g），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證：SCXK（京）2014-0003。ZDF大鼠予高脂飼料#5008（粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%）喂養，ZL大鼠予普通飼料＃1022（粗蛋白%≥18.0、粗脂肪% ≥4.0、粗纖維%≤5.0、水分%≤8.0）喂養，飼料購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2009-0008。大鼠在北京中醫藥大學基礎醫學院實驗室中飼養，實驗室溫度20～22℃，相對濕度（55± 5）%，12/12 h光照黑暗循環 （光照時間8∶00～20∶00，黑暗時間20∶00-～8∶00）。實驗前均予普通飼料適應性喂養1周，所有實驗大鼠自由獲取食物和飲水。將造模成功的ZDF大鼠隨機分為模型組（n=10），苦酸通調組（n=10）、吡格列酮組（n=10）3組，10只ZL大鼠為空白對照組。將苦酸通調方和吡格列酮分別配置成混懸液，造模成功后，苦酸通調方使用時按照3.29 g/（kg·d）體質量（前期工作已確定的最佳劑量）混懸液灌胃，吡格列酮組按照1.07 mg/（kg·d）體質量灌胃，正常對照組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃，各組大鼠均連續灌胃12周，每日1次。用藥治療期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其他組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱質量，根據體質量調整灌胃劑量。

1.2 試藥與儀器 FAS、GAPDH抗體，Anti-FAS、Anti-GAPDH抗體、化學發光液（美國CST公司）；蛋白裂解液+苯甲基磺酰氟 （PMSF）（上海碧云天生物技術公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒包括A液100 mL、B液5 mL、蛋白標準品1 mL（上海碧云天生物技術公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；苦酸通調方（黃連15 g，烏梅15 g，大黃10 g，干姜6 g），長春中醫藥大學附屬醫院顆粒藥房提供；吡格列酮，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司（批號：國藥準字H20040631）等。主要儀器包括：調節臺式高速低溫離心機 （HERAEUS Fresco 17，Thenno Scientific，USA）；溫控震蕩儀（Thenno Scientific，USA）；電泳儀、電泳及電轉移裝置（PowerPac Basic，Bio-Rad，USA）；酶標儀（Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad公司，USA）；凝膠圖像處理系統 （上海產Tanon GIS-1000）。

1.3 模型制備 實驗用ZDF以及ZL大鼠均分籠飼養，每籠2只。實驗過程中，大鼠可以自由進食和飲水。實驗開始前大鼠均給予適應性喂養，飼料采用普通級。實驗開始后，ZL組繼續給予普通飼料而ZDF組大鼠給予高脂飼料喂養。12周后，檢測造模情況。造模評價標準：糖耐量實驗，檢測前禁食不禁水15 h，血糖儀檢測大鼠空腹血糖，然后給予30%葡萄糖溶液灌胃（2 g/kg）。分別在灌胃后0.5、1、1.5、2 h取血并測量血糖。血糖峰值高于16.7 mmol/L，或糖負荷2 h后血糖高于11.1 mmol/L，可判定造模成功。如僅具備上述1條，則為糖耐量減低。

1.4 標本采集與檢測 給藥治療12周后，將大鼠處死后打開腹腔，迅速取出腹部脂肪組織，把組織剪切成細小的碎片，PMSF與PIPA裂解緩沖液以1∶100的比例加入組織中，渦旋振蕩，冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，將勻漿液其置于EP管中，4℃、13000 r/min離心30 min，收集中層清液，用于檢測FAS蛋白的表達。蛋白免疫印跡實驗檢測脂肪組織FAS蛋白表達，細胞經裂解液處理后收集蛋白用BCA法進行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳、電轉、據蛋白質Marker不同分子量條帶的所在位置切下預計含目的蛋白的PVDF膜，放置于封閉緩沖液中。分別加入相應一抗FAS、GAPDH以1∶1000比例1.2 μL抗體混于1.2 mL封閉緩沖液，后置于4℃低溫震蕩儀過夜。次日洗膜4次后，加入二抗，同樣以1∶1000比例1.2 μL抗體混于1.2 mL TBST中，室溫震搖1 h。再次洗膜4次后進行曝光，顯影，定影。采用蛋白電泳圖像分析軟件Gel-pro32（Labwork）分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白灰度值除以內參GAPDH灰度值來表示目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件分析。實驗數據計量資料以（±s）表示，服從正態分布的兩組間均數比較用t檢驗，同批次多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量比較 見表1和圖1。經藥物治療12周后，模型組、吡格列酮組、苦酸通調組體質量均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。治療4周后，中藥組、西藥組體重與模型組相比，雖有下降趨勢，但無統計學意義（P＞0.05）。治療8周、12周后，苦酸通調組體質量與模型組相比明顯下降，吡格列酮組與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。苦酸通調方可降低糖尿病大鼠體質量，提高胰島素敏感性，說明苦酸通調方能調節糖脂代謝、減輕體質量、提高胰島素敏感性，從而改善IR。

表1 各組大鼠藥物體質量比較（g，±s）

表1 各組大鼠藥物體質量比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與吡格列酮組比較，※P＜0.05。下同。

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圖1 大鼠體質量變化

2.2 各組大鼠FAS蛋白表達的比較 見表2和圖2。采用蛋白電泳圖像分析軟件Gel-pro32（Labwork）分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白灰度值除以內參GAPDH灰度值來表示目的蛋白相對表達量。結果顯示，與正常組比較，模型組FAS蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。吡格列酮治療組和苦酸通調方治療組，可明顯降低FAS蛋白表達，與模型組比較有明顯改善（P＜0.01），兩組之間有差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組大鼠腹部脂肪組織中FAS陽性表達明顯增加，苦酸通調方組FAS陽性表達則明顯下降，從蛋白水平進一步說明FAS可能是苦酸通調方的作用靶點，可以阻滯生脂通路，控制脂肪合成、減少體質量，從而減輕胰島素抵抗。

表2 各組大鼠FAS相對蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠FAS相對蛋白表達比較（±s）

組別 n FAS/GAPDH正常對照組 10模型組 10吡格列酮組 10 0.097±0.008 0.443±0.075*0.095±0.013△△苦酸通調組 10 0.082±0.021△△

圖2 各組大鼠FAS相對表達量

3 討 論

3.1 “六郁和絡滯”為T2DM的病機關鍵 糖尿病屬中醫學“消渴”范疇，發病原因主要由飲食偏好如嗜食肥甘，從而導致食郁中焦，氣機運化失常，邪毒內生，最終出現一系列臨床表現。“六郁和絡滯”學說的創立，高度概括了肥胖T2DM脂代謝紊亂和脂肪組織炎癥的發病機制，該理論的提出具有科學性與前瞻性。本課題組提出2型糖尿病的中醫病機核心是 “六郁和絡滯”，囊括了2型糖尿病早期無明顯三多一少癥狀的情況。六郁是指以食郁為先導而形成的氣郁、熱郁、血郁、痰郁、濕郁的病理狀態；絡滯是由六郁交互作用而形成脈絡郁滯的病理狀態［7］。

機體在六郁的病理狀態下，久而化生膏、濁、痰、瘀、毒等病理產物，病理產物久而不化，留于全身經絡各處，或堆積于肓膜之上，或散布于肌肉腠理之間，或蘊藏于胸腹之中，形成絡滯的病理狀態，故“六郁和絡滯”可能是T2DM患者多體形臃腫的原因。如能夠及時清除致病的病理產物，改善內環境，就能夠有效地改善脂肪組織相關的微炎癥、脂代謝紊亂狀態，進而減輕體重，改善患者臨床癥狀。

針對上述T2DM的核心病機，本課題組提出苦酸通調的中醫治療法則。苦酸通調法是對 “解毒通絡”、“苦酸制甜”和單一治法學說的高度概括，“解毒通絡”法以長期臨床經驗為基礎［8］，根據絡病治療法則而設，“苦酸制甜”理論則基于藥物四氣五味的藥性理論而來［9］，研究表明［10］，T2DM 早期即存在絡脈郁滯，且貫穿T2DM始終。

苦酸通調方由黃連15 g，烏梅15 g，大黃10 g，干姜6 g組成。本方為源自《溫病條辨》連梅湯加大黃、干姜而成，君用黃連、大黃，苦寒泄壅解毒，破積化瘀；烏梅收斂生津，以防苦寒傷陰，黃芩燥濕解毒，此兩藥共為臣藥；佐以干姜、白芍，用以調暢氣機，養血柔肝，收斂氣陰，且反佐苦寒藥物之偏弊，故為二者共為佐使。該方體現了治療消渴病“糖絡并治”的理論。

3.2 苦酸通調方對2型糖尿病IR大鼠體質量與腹部脂肪組織中FAS蛋白表達的影響 FAS是催化乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和NADPH合成飽和長鏈脂肪酸的關鍵酶［11-14］。它能經轉酰、縮合、還原、脫水和再還原的重復過程合成脂肪酸，而脂肪酸是合成三酰甘油的重要原料。糖尿病的脂質代謝紊亂與肝臟FAS表達的變化有密切關系。在2002年ADA會議上Mc Garry［15］提出了“糖尿病是糖脂病”的概念。苦酸通調方組可明顯降低腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達，與模型組比較有明顯改善。實驗結果說明2型糖尿病的糖脂代謝紊亂與FAS有關聯。苦酸通調方可以通過對體內合成脂肪途徑中的關鍵酶之一FAS起抑制作用，減少脂肪沉積，控制脂肪合成、減少體質量，增強胰島素敏感性。FAS可能是苦酸通調方的作用靶點，其機制可能與干預機體內脂肪組織的合成、分解代謝、進而改善胰島素抵抗作用有關。

［1］ Kukidome D，Nishikawa T，Sonod K，et al.Activation of activated protein kinase reduces hyperglycemi induced mitochondrial reactive oxygen species prodution and promotes mitochondrial biogenesis in human umbilical vein endotheli al cells［J］.Diabetes，2006，55（1）：120-127.

［2］ Weyer C，Foley JE，Bogardus C，et al.Enlarged sub cut aneousab-dominala dipocy te size，but not obesity itsel，fpredictstypeⅡdia-betes independent of insulin resis tance［J］.Diabe to logia，2000，43：1498-1506.

［3］ Kim EK，Miller I，Landree LE，et al.Expression of FAS within hypothalamic neurous：a model for decreased food intake after C75 treatmet［J］.Am J Physicl Endocrinol Metab，2002，283 （5）：E867-879.

［4］ Obici S，Feng Z，Arduini A，et al.Inhibition of hypothalamic camitine palm itoyltransferase-I decreases food intake and glucose production［J］.Nat Med，2003，9（6）：756-761.

［5］ Kumar MV，Shimokawa T，Nagy TR，et al.Differential effects of acentrally acting fatty acid synthase inhibitor in lean and obese mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（4）：1921-1925.

［6］ Thupari JN，Landree LE，Ronnett GV，et al.C75 increases peripheral energy utilization and fatty acid oxidation in dietinduced obesity［J］.Proc Natl Acad ScUSA，2002，99（4）：9498-9502.

［7］ 樸春麗，鄧悅，米佳.苦酸通調法抑制糖尿病脂肪組織炎癥機制的理論探討［J］.中華實用中西醫雜志，2009，22（3）：146-148.

［8］ 于淼，樸春麗，南征，等.2型糖尿病胰島素抵抗的肝內炎癥發病機制與毒損肝絡病機理論的相關性探討［J］.中國中西醫結合雜志，2006，26（11）：1032-1034.

［9］ 劉彥君，潘長玉.自發的2型糖尿病動物模型—OLETF大鼠［J］.國外醫學內分泌學分冊，1999，19（1）：26-29.

［10］Wang H，Kourig，Wollheim CB.ER stress and SREBP-1 activation are implicated in beta-cell glucolipotoxicity［J］.Cell sci，2005，118（pt117）：3905-3915.

［11］Wakil SJ，Stoops JK，Joshi VC.Fatty acid synthesis andits regulation［J］.Annu Rev Biochem，1983，52：537-579.

［12］Wakil SJ.Fatty acid synthase，a proficient multifunctionalenzyme［J］.Biochemistry，1989，28（11）：4523-4530.

［13］Smith S.The animal fatty acid synthase：one gene，onepolypeptide，seven enzymes［J］.Faseb J，1994，8（15）：1248-1259.

［14］Smith S，Witkowski A，Joshi AK.Structural and functionalorganization of the animal fatty acid synthase［J］.Prog Lip-id Res，2003，42（4）：289-317.

［15］Mc Garry JD.Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiologoftype 2 dia betes［J］.Diabetes，2002，51（1）：7-18.

Effects of Kusuan Tongtiao Decoction on FAS Expression in Abdominal Adipose Tissue of Spontaneous Type 2 Diabetes Mellitus in Rats with Insulin Resistance

JIN Meiying，GAO Shengnan，PIAO Chunli.Hospital Affiliated to Changchun University of Chinese Medicine，Jilin，Changchun 130117，China.

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1484-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.009

吉林省自然科學基金項目（201115169）

（電子郵箱：piaochunli9811027@yahoo.com.cn）

2016-04-20）