銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響*

白志超陳名超李鶴飛（.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 05600；.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲05600）

銀杏內(nèi)酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響*

白志超1△陳名超2李鶴飛1
（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲056002）

目的 觀察銀杏內(nèi)酯B（GB）對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響并探討其機制。方法將120只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組，GB高、中、低劑量組和地爾硫組，每組20只；采用夾閉冠狀動脈的方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。TTC染色法計算心肌梗死面積，生化分析法檢測心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性，HE染色法觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，TUNEL法觀察心肌細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù) （AI）；Western blot法檢測心肌組織中NF-κB蛋白表達并進行半定量分析。結(jié)果 與模型組比較，GB高中低劑量組大鼠心肌組織梗死面積顯著降低，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，血清中AST、CPK、LDH活性顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）；GB各組心肌組織病變和心肌細胞凋亡狀況較模型組均呈不同程度改善，其中30、60 mg/kg組AI顯著降低，NF-κB蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 GB具有抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，這一作用可能與其能夠降低心肌缺血再灌注后心肌損傷有關(guān)。

銀杏內(nèi)酯B 心肌 缺血再灌注 氧化應(yīng)激 影響

【Abstract】Objective：To investigate the effects and mechanism of Ginkgolide B（GB）on oxidative stress in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods：120 rats were randomly divided into six groups：the sham group，the model group，GB high/middle/low groups and diltiazem group，20 in each.The models with myocardial ischemia-reperfusion injury were made by clamping the artery.The areas of myocardial infarction was analyzed by TTC staining；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in myocardial tissue were determined，as well as the activity of AST，CPK，LDH in serum；the histopathological changes of myocardial tissue was observed by HE staining；the apoptosis of cardiomyocytes was observed by TUNEL and the apoptosis index（AI）was calculated；the expression of NF-κB was examined by Western blotting and semi-quantitative analysis.Results：Compared with the model group，the myocardial infarction areas in GB（30，60 mg/kg）groups were significantly decreased；the activity of SOD，GSH-Px and CAT were significantly increased and the activity of MDA was significantly decreased；the level of AST，CPK and LDH in serum were significantly decreased；the myocardial tissue histopathological changes and cardiomyocytes apoptosis were significantly improved；AI in GB （30，60 mg/kg）groups were significantly decreased；the expression of NF-κB was significantly decreased.All of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：GB has inhibitive effects on oxidative stress in the rats with myocardial ischemia-reperfusion injury，which is perhaps related to its effects on reducing myocardial injury after myocardial ischemia-reperfusion.

【Key words】GB；Myocardial；Ischemia-reperfusion；Oxidative stress；Effects

近年來，急性心肌梗死的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為危害人類生命健康的主要疾病之一。臨床上采取溶栓、介入手術(shù)等方法及時恢復(fù)血流供應(yīng)，能夠顯著降低急性心肌梗死患者死亡率，但再灌注后，缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴重影響著患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注后氧自由基的大量產(chǎn)生與過剩而導(dǎo)致的廣泛的氧化應(yīng)激損傷是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)之一［1］。銀杏內(nèi)酯B（GB）為中藥銀杏葉的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗感染等多種藥理學(xué)作用［2-4］。本實驗通過制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型并給予GB進行干預(yù)治療，研究GB對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠120只，雄性，8周齡，體質(zhì)量220～260 g。購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。溫度23～25℃，相對濕度65%～70%，光照周期為12 h︰12 h。

1.2 藥物與試劑 GB購自美國Sigma公司，純度≥90%；注射用鹽酸地爾硫，批號1503019，購自天津田邊制藥有限公司；TTC購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；NF-κB單抗購自碧云天生物技術(shù)有限公司；水合氯醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 分組與造模 120只實驗用SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組，模型組，GB高、中、低劑量（15、30、60 mg/kg）組和地爾硫組，每組20只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照徐淑云等［5］報道的實驗方法制備心肌缺血再灌注大鼠模型。假手術(shù)組行手術(shù)通路，除不夾閉冠狀動脈外，其余操作同手術(shù)組。取GB準(zhǔn)確稱量，用0.9%氯化鈉注射液配制成濃度為60 mg/mL的溶液，并依此稀釋制備30 mg/mL和15 mg/mL的GB溶液；取地爾硫準(zhǔn)備稱量并用0.9%氯化鈉注射液配制成1 mg/mL的地爾硫溶液；為保證給藥容積一致，各治療均腹腔注射給藥1 mL進行治療。再灌注后，GB各組和地爾硫組立即通過腹腔注射給藥1 mL進行治療，每日1次，療程7 d，假手術(shù)組和模型對照組同步給予1 mL 0.9%氯化鈉注射。治療完成后，行各指標(biāo)的觀察和檢測。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）心肌組織梗死面積的測定。各組大鼠腹腔注射水合氯醛深度麻醉后開胸取心臟組織，-20℃凍存20 min后切片，1%TTC溶液（恒溫37℃、避光）孵育15 min，正常組織呈紅色、梗死區(qū)呈灰白色，采用BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析心肌組織梗死面積。2）生化指標(biāo)檢測。深度麻醉后開腹經(jīng)腹主動脈取血并離心（1500 r/min，10 min）取血清，按照各試劑盒操作方法依次進行處理，然后通過生化分析儀平行測定各組大鼠血清中AST、CPK、LDH活性。參照“1）方法”取心肌組織，研磨勻漿后經(jīng)3000 r/min，離心10 min后取上清液，按照試劑盒操作方法依次進行處理，然后通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。3）心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和心肌細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)AI的計算。參照“1）方法”取心肌組織，4%多聚甲醛溶液固定72 h后行石蠟包埋，切片和展片處理后，進行HE染色和封片處理，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；取石蠟切片，按照TUNEL試劑盒操作方法行染色處理，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌細胞凋亡狀況。AI的計算：每張染色切片隨機選取6個視野，分別計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，各組分別取平均值后計算AI（%）=（陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。4）心肌組織中NF-κB蛋白表達的檢測。取以上制備的心肌組織勻漿液，經(jīng)12000 r/min，低溫（4℃）離心10 min后取沉淀，BCA法蛋白定量后采用Western blot法測定各組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達，應(yīng)用Quantity One軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織梗死面積比較 見表1。模型組大鼠心肌組織梗死面積較假手術(shù)組顯著升高 （P＜0.01）。GB中高劑量組和地爾硫組大鼠心肌梗死面積較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠心肌組織中抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

表1 各組大鼠心肌組織中抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.2 各組大鼠心肌組織中抗氧化酶活性和MDA含量比較 見表1。模型組SOD、GSH-Px、CAT活性較假手術(shù)組顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GB中高劑量組SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較 見表2。模型組大鼠AST、CPK、LDH含量較假手術(shù)組均顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，GB中高劑量組AST、CPK、LDH含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較（U/L，±s）

表2 各組大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比較（U/L，±s）

?

2.4 各組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 見圖1。經(jīng)HE染色后觀察病理切片發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和心肌細胞狀態(tài)均未見異常；而模型組大鼠呈現(xiàn)心肌纖維紊亂，間質(zhì)水腫變性，心肌細胞呈空泡變性、胞質(zhì)著色不均、胞核固縮等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；而與模型組比較，GB各組心肌組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度改善，其中以GB高劑量量組效果最為顯著。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡狀況 見圖2，表3。模型組心肌細胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；而GB各組心肌細胞凋亡數(shù)量較模型組呈不同程度減少，以GB高劑量組最為顯著，計算并比較AI發(fā)現(xiàn)：與手術(shù)組比較，模型組心肌細胞AI顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，GB（30、60 mg/kg）組AI顯著降低（P＜0.01）。

2.6 各組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達 見圖3，

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡狀況（HE染色，400倍）

表3 各組大鼠心肌細胞AI、心肌組織NF-κB蛋白表達（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞AI、心肌組織NF-κB蛋白表達（±s）

表3。模型組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達較假手術(shù)組顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，GB中高劑量組NF-κB蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），

組別 n假手術(shù)組 20模型組 20 GB低劑量組 20 AI（%） NF-κB/β-actin 3.73±1.59 0.15±0.04 58.24±10.51**0.47±0.12**46.07±8.02 0.38±0.10 GB中劑量組 20 39.01±7.23△0.30±0.07△△GB高劑量組 20 27.46±6.28△△0.23±0.06△△地爾硫組20 41.29±8.05△0.33±0.08△

圖3 各組大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達

3 討 論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和工作勞動強度的改變，急性心肌梗死發(fā)病率逐年升高，目前臨床上主要采取溶栓、介入手術(shù)等方法及時恢復(fù)血流供應(yīng)，雖能夠挽救部分瀕死心肌細胞并顯著降低急性心肌梗死患者死亡率，但“缺血再灌注損傷”并發(fā)癥的存在仍嚴重影響著患者的預(yù)后。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，再灌注后隨著氧的涌入和抗氧化酶活性的降低氧自由基大量產(chǎn)生和過剩，引發(fā)廣泛的氧化應(yīng)激損傷可能是心肌缺血再灌注損傷重要的病理機制［1］，因此抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)或許是降低心肌缺血再灌注損傷的新靶點。

正常生理狀態(tài)體內(nèi)生成的氧自由基能夠在SOD的催化作用下還原生成H2O2［6-7］，并在GSH-Px或CAT進一步催化還原生成H2O和O2［8-10］，而維持體內(nèi)氧自由基的動態(tài)平衡，所以此3種酶活性能夠直接反應(yīng)機體抗氧化能力；過氧化終產(chǎn)物MDA的含量能夠間接反映細胞氧化應(yīng)激損傷程度。正常狀態(tài)下血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）活性都非常低，但細胞膜受氧自由基攻擊而過氧化損傷后，心肌酶將迅速釋放入血，導(dǎo)致血清中含量陡然增高，因此血清中心肌酶含量水平能夠準(zhǔn)確反映神經(jīng)細胞受氧自由基損傷程度［11-12］。

氧化應(yīng)激損傷是細胞凋亡的重要誘發(fā)因素之一，而多效能核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白被稱為連接氧化應(yīng)激和細胞凋亡的“橋梁”。生理狀態(tài)下NF-κB以無活性形式存在于胞質(zhì)中，被氧自由基刺激而活化的NF-κB蛋白能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導(dǎo)促凋亡信號釋放而導(dǎo)致細胞凋亡［13-14］；并且被活化的NF-κB進入細胞核后能夠與DNA的相應(yīng)位點結(jié)合，參與調(diào)控下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達［15］。

銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M和白果內(nèi)酯。研究表明銀杏內(nèi)酯為血小板活化因子（PAF）拮抗劑，活性最強的即為GB，具有抗炎、抗氧化，抗感染等多種藥理學(xué)作用［2-4］。本實驗通過制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型并給予GB進行干預(yù)治療研究發(fā)現(xiàn)：GB能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并降低心肌組織梗死面積；改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性、降低MDA含量，降低血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，下調(diào)NF-κB蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡，提示GB能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而對心肌缺血再灌注損傷大鼠起到保護作用。

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The Effects of Ginkgolide B on Oxidative Stress in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

BAI Zhichao，CHEN Mingchao，LI Hefei.Central Hospital of Handan，Hebei，Handan 056001，China.

R285.5 文獻標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）08-1480-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.008

河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃（20130359）

（電子郵箱：xtrmyyph@163.com）

2016-03-14）